肺浸潤性腺癌組織中去泛素化酶USP17與基質金屬蛋白-9 的表達研究*

張勝超， 陳 浩， 秦 宣， 徐正浪，姚俊霞

復旦大學附屬中山醫院青浦分院 (上海 201700)

肺浸潤性腺癌臨床較為常見，常見于中老年人，與機體基因表達失常的關聯性較強。去泛素化酶是蛋白酶家族，能特異性調節酶蛋白和底物結合，調節細胞周期及腫瘤細胞的增殖[1]。去泛素化酶USP17(USP17)蛋白酶家族中的重要成員，其對腫瘤細胞的增殖可能有一定作用[2]。USP17的作用需要網格蛋白介導的表皮生長因子受體參與，通過調節Ras、Myc和MMPs等蛋白促進遷移[3]。MMP-9是基質金屬蛋白酶家族中的經典成員，是明膠酶的一種，可以有效降解基底膜，為轉移提供通路[4]。USP17與MMP-9在肺腺癌中的表達及相關性尚未見報道。本研究應用免疫組化方法針對肺浸潤性腺癌術后組織進行二種蛋白的檢測，分析其意義。

資料和方法

1 一般資料 選擇2014年1月至2016年12月在我院確診為肺浸潤性腺癌的患者共75例作為觀察組，男35例，女40例，年齡40～86(63.1±6.2)歲。納入標準：①符合WHO中肺浸潤性腺癌的病理學診斷標準；②原發腫瘤。排除標準：①轉移性腺癌；②合并其它器官惡性腫瘤；③有呼吸系統先天發育異常；④術前行放、化療者。選擇正常肺組織32例作為對照組，男女各16例，年齡42～79(62.2±5.9)歲。均留取石蠟包埋組織，兩組常規資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。研究經倫理委員會批準，納入對象家屬簽屬知情同意書。

2 USP17和MMP-9的檢測 USP17和MMP-9的表達應用免疫組化二步法。選上海漢尹生物科技有限公司的USP17和MMP-9試劑。以50為梯度分組先行預實驗染色后，由病理醫師對結果進行判讀，選擇USP17是1∶50、MMP-9是1∶100的顯色最佳的濃度進行實驗。正式實驗均由同一實驗師一次完成、DAB顯色，嚴格按說明書進行操作，做好質控工作。

3 結果判定 免疫組化判定：二種蛋白陽性部位是細胞質，按二維方法進行客觀評分，即：著色強度：無、弱、中、強分別計為0、1、2、3分：陽性率：隨機選擇2個400倍顯微鏡下的視野，以<5%、5%～10%、11%～30%、31%～50%、>50%分別計為0、1、2、3、4分。二者相加為總分(0～7分)，陰性標準為≤3分，陽性標準為>3分。以上均由病理醫師盲法評價。

4 統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件對數據進行相關分析，行卡方或t檢驗、方差分析、生存分析和線性相關性分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1 兩組中USP17和MMP-9蛋白的表達 兩組中USP17和MMP-9表達的陽性率差別有統計學意義，見表1、圖1～4。

圖1 肺腺癌中USP17陽性表達(IHC 400倍)

圖2 肺腺癌MMP-9陽性表達(IHC 200倍)

圖3 正常肺組織中USP17陰性表達(IHC 100倍)

圖4 正常肺組織中MMP-9陰性表達(IHC 100倍)

組 別nUSP17+-χ2值P值MMP-9+-χ2值P值觀察組7533(44.0)42(56.0)7.8860.00540(53.3)35(46.7)10.9460.001對照組325(15.6)27(84.4) 6(18.8)26(81.3)

2 觀察組中兩種蛋白在不同臨床病理特征中的比較 觀察組中USP17和MMP-9的表達量與有無癌栓、分化程度及淋巴結轉移有關，USP17的表達與腫瘤的增殖指數和腫瘤大小有關，見表2。

3 觀察組中USP17和MMP-9表達的相關性分析 線性相關性分析顯示觀察組中USP17和MMP-9的表達具有正相關性(r=0.35，P=0.0490)。

4 觀察組中USP17和MMP-9的生存分析 觀察組隨訪的終點時間5～60(19.5±6.8)月，生存分析顯示USP17和MMP-9與生存時間有關(P<0.05)。即USP17和MMP-9陽性率高者生存時間短，預后差。

表2 觀察組中USP17和MMP-9在不同臨床病理特征中的比較[例(%)]

討論

泛素化修飾是細胞內常見的蛋白修飾方式之一，廣泛參與了機體正常生理以及病理過程。泛素化修飾的分子參與腫瘤發生發展的各個進程中，包括周期調控，抗凋亡，免疫逃逸，血管新生和侵襲轉移等[5]。其中，泛素E3連接酶和去泛素化酶(DUBs)控制了泛素修飾途徑的特異性，被認為是泛素修飾系統的重要部分。去泛素化酶通過水解泛素羧基末端的酯鍵或異肽鍵，將其從連接有泛素的蛋白上水解。去泛素化酶包括5個家族，分別為泛素羧基末端水解酶家族(UCHs)、泛素特異性加工酶家族(USPs)、MPN(+)/JAMM蛋白酶、卵巢腫瘤相關蛋白酶(OTU)及Ataxin-3[6]。已報道，發現去泛素化酶OTUD6B、USP9X等參與肺癌的發展[7]。USP17作為一個新發現的去泛素化酶，介導了包括炎癥、細胞運動、Th17細胞發育及腫瘤發生等多個重要過程。USP17可通過調控細胞內Ras和小GTPase的活性影響細胞的增殖和運動能力[8]。不僅如此，研究還發現USP17在多種腫瘤細胞中高表達，預示著USP17很可能是一個先前未發現的致癌基因[9]。去泛素化酶USP17與非腫瘤細胞的惡性生長和侵襲密切相關。干擾USP17后，肺癌細胞的克隆形成能力和侵襲能力明顯削弱，不僅如此，干擾后的肺癌中侵襲相關的蛋白MMP-3和MMP-9表達顯著降低。USP17過表達能增強神經節的線粒體運輸，提高細胞的增殖能力[10]。USP17具有N端的CDC25結構域，能通過催化4,5-二磷酸鹽進行水解，產生二脂酰甘油，激發蛋白激酶C的過表達[11]。MMP-9作為侵襲相關蛋白，在腫瘤進展時腫瘤細胞可以高度分泌。MMP-9的作用底物是IV型和V型膠原，能直接分解基底膜中多種間質成份，有效對基質進行降解[12]。目前認為MMP-9還具有其它的作用，如對凋亡的抑制、對增殖的影響。近年也有研究認為MMP-9對腫瘤間質的血管生成有促進作用[13]。相對于缺氧誘導因子(HIF-1a)和血管內皮生長因子(VEGF)，MMP-9是相對晚期的血管生成因子，即在腫瘤進展中MMP-9對血管生成的作用更明顯。MMP-9能促進CD31、CD34陽性的血管內皮的增生和繁殖[14]。

本研究結果顯示觀察組中USP17和MMP-9的表達明顯高于對照組，提示二者高表達可以促進肺浸潤性腺癌的形成過程，二者具有癌基因樣的生物學作用。結果顯示觀察組中USP17和MMP-9的表達與癌栓及淋巴結轉移密切相關，提示二者在脈管播散過程中有一定作用，也是判定腫瘤轉移的風險因子。結果顯示二者的表達與分化程度相關，提示二者參與細胞的幼稚到成熟的進展過程，二者對調節干細胞的轉化可能也有一定的作用。由于以上因素與生物學行為及預后相關，因此檢測二者的表達與判斷預后可能有一定的關聯，生存分析直接證實了檢測二者與預后的關系，即USP17和MMP-9高表達者預后差。結果顯示USP17的表達與Ki67指數和最大徑有關，提示USP17是增殖相關蛋白，能引起腫瘤細胞的增殖和腫瘤的生長。相關分析顯示觀察組中USP17和MMP-9的表達具有正相關性，顯示二者可能有協同作用，USP17可能是MMP-9的上游因子，即USP17通過MMP-9促進腫瘤細胞的遷移。但USP17和MMP-9促進腫瘤進展的機制可能完全不同。USP17具有血管生成的促進作用，但是其對血管生成因子家族相關成員的調控是間接的[15-16]。USP17分泌增加，引起腫瘤細胞生長和分化，通過調控P53和Ras等基因，引起腫瘤的形成。MMP-9可以有多種生物學功能，如通過識別ECM及細胞膜上免疫蛋白超家族粘附分子、細胞間粘附分子等介導腫瘤細胞的粘附作用，引起細胞信號傳導異常，促進同質型粘附力的下降，使腫瘤細胞易于離開原發灶，使異質型粘附力增強，使腫瘤細胞具有異源性部位的定植能力。MMPs家族中相關成員(MMP-9和MMP-14)激活后，生物學功能多樣化，對腫瘤細胞的進展作用明顯增強，遷移加速，這可能是腫瘤轉移的重要因素[17]。

總之，USP17和MMP-9在肺浸潤性腺癌術后組織高表達，且具相關性，能對腫瘤的形成和發展有一定的調節作用。