一株冬蟲(chóng)夏草菌的鑒定及其抗氧化特性研究

丁浩 安超 薛文嬌

摘要：對(duì)分離自野生冬蟲(chóng)夏草（Cordyceps sinensis）的一株真菌F4539進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，并對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行抗氧化活性研究。結(jié)果表明，F(xiàn)4539（Genbank號(hào)為KU359775）與Hirsutella sinensis（AJ309355）具有99%的相似性，初步確認(rèn)F4539為中華被毛孢（Hirsutella sinensis）?？寡趸钚栽囼?yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)4539發(fā)酵物20 g/L乙醇提取液的DPPH抗氧化活性為75.39%，高于同濃度國(guó)產(chǎn)某商品化冬蟲(chóng)夏草菌菌絲體膠囊乙醇提取物的抗氧化活性，進(jìn)一步研究表明，F(xiàn)4395發(fā)酵物和國(guó)產(chǎn)某商品清除DPPH自由基的IC50分別為5.96 g/L和11.61 g/L，即F4539發(fā)酵提取物清除DPPH自由基的能力強(qiáng)于國(guó)產(chǎn)某商品。

關(guān)鍵詞：冬蟲(chóng)夏草（Cordyceps sinensis）；中華被毛孢（Hirsutella sinensis）；抗氧化

中圖分類(lèi)號(hào)：S567.3+5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）03-0057-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.03.016 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： A fungus numbered F4539 was isolated from wild Cordyceps sinensis and identified by morphology and molecular biological identification， in addition， the antioxidant activity for the fermentation products were studied. The results demonstrated that F4539（Genbank： KU359775） had relatively high similarity in evolution with Hirsutella sinensis（AJ309355）， it was confirmed that F4539 was Hirsutella sinensis； Antioxidant activity tests showed that the DPPH antioxidant activity was 75.39% with a concentration of 20 g/L ethanol extract from F4539 fermentation products， which was higher than the same concentration of ethanol extracts from the certain commercial Cordyceps sinensis mycelium capsule. Further research showed that the IC50 of F4539 fermentation products and commercial Cordyceps sinensis mycelium capsule were 5.96 g/L and 11.61 g/L respectively. It was shown that the antioxidant activity was higher in F4539 fermentation products than the commercial Cordyceps sinensis mycelium capsule.

Key words： Cordyceps sinensis； Hirsutella sinensis； antioxidant

冬蟲(chóng)夏草（Cordyceps sinensis）隸屬麥角菌科蟲(chóng)草屬，是鱗翅目蝙蝠蛾科蝠蛾屬幼蟲(chóng)被中華被毛孢（Hirsutella sinensis）寄生后形成的蟲(chóng)菌復(fù)合體，為中國(guó)的珍貴中藥材之一，具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等功效[1]。它分布于中國(guó)青藏高原的西藏、青海、四川、甘肅和云南等地以及印度、尼泊爾和不丹等國(guó)的部分地區(qū)。主產(chǎn)于西藏的那曲、林芝、昌都地區(qū)，青海的玉樹(shù)、果洛州一帶，四川的阿壩州、甘孜州，云南迪慶州德欽、中旬以北一帶以及甘肅省甘南州瑪曲以西等地。由于野生冬蟲(chóng)夏草分布地區(qū)狹窄、自然寄生率低、對(duì)生活環(huán)境條件要求苛刻，所以本身資源比較有限，再加上自然因素（如天氣干旱、氣候變暖等），天然資源日益匱乏。

近年來(lái)由于冬蟲(chóng)夏草主產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境遭到人為破壞，大量盲目不合理采挖致使資源日趨減少，產(chǎn)量逐年下降，導(dǎo)致天然冬蟲(chóng)夏草的價(jià)格昂貴，自20世紀(jì)以來(lái)，人們開(kāi)始探索用人工方法培育仿冬蟲(chóng)夏草。迄今為止，深層發(fā)酵研究已取得了較大的進(jìn)展，且生產(chǎn)出的替代品（如菌絲體）的成分和藥效也與天然蟲(chóng)草相似[2]。中華被毛孢已經(jīng)被證實(shí)為冬蟲(chóng)夏草的無(wú)性型[3，4]。

由于冬蟲(chóng)夏草的全人工培養(yǎng)技術(shù)尚未成熟，現(xiàn)階段人們采用發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌無(wú)性型中華被毛孢，通過(guò)提取菌絲活性成分替代天然冬蟲(chóng)夏草的藥用價(jià)值，而由于此前關(guān)于冬蟲(chóng)夏草無(wú)性型的爭(zhēng)議，導(dǎo)致多數(shù)研究冬蟲(chóng)夏草菌的發(fā)酵試驗(yàn)中的菌種不是中華被毛孢。因此，在通過(guò)發(fā)酵法生產(chǎn)冬蟲(chóng)夏草替代品的產(chǎn)業(yè)化前進(jìn)行菌株的篩選、鑒定及生物活性測(cè)定非常重要。本試驗(yàn)對(duì)前期分離自野生冬蟲(chóng)夏草的一株真菌F4539進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果表明其為中華被毛孢，同時(shí)研究了其發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌和抗氧化活性，旨在為進(jìn)一步產(chǎn)業(yè)化的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

F4539菌株，從野生冬蟲(chóng)夏草中分離選育獲得，在-80℃超低溫冰箱保存。

活化培養(yǎng)基：蔗糖50 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母粉3 g/L，無(wú)水氯化鈣0.3 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，氯化鈉1.0 g/L，五水硫酸銅0.01 g/L，七水硫酸亞鐵0.01 g/L，四水氯化錳0.01 g/L，二水氯化鋅0.01 g/L，瓊脂16 g/L，pH 5.6～6.0。

種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基和不加瓊脂的活化培養(yǎng)基。

指示菌培養(yǎng)基為商品化營(yíng)養(yǎng)瓊脂（北京澳博星生物科技公司）。

其他試劑：無(wú)水乙醇，DPPH（Sigma）。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S萬(wàn)分之一天平（Sartorious），UB-7型pH測(cè)定儀（Sartorious），5804R離心機(jī)（Eppendorf），SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)（蘇凈安泰），HUA-85型滅菌鍋（HIRAYAMA），ZHWY-2012型恒溫?fù)u床（上海智誠(chéng)科技有限公司），BX41型顯微鏡（OLYMPUS），Synergy H1型多功能酶標(biāo)儀（BioTek），Gel DocTM型凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RAD），2720 Thermal cycle型PCR儀（Applied Biosystems）。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化與發(fā)酵培養(yǎng) -80 ℃保藏的菌種接種至活化培養(yǎng)基，于18 ℃培養(yǎng)45 d，將活化好的菌種接種于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中于18 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)20 d，然后按照5%接種量進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度18 ℃，培養(yǎng)時(shí)間20 d。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定 取培養(yǎng)20 d的種子液，離心獲得菌體，通過(guò)液氮研磨后，采用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver. 5.0（Code No. 9765）提取總DNA。PCR選用真菌鑒定常用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4

（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（50 μL）為10×Extaq buffer 5 μL，dNTP （800 μmol/L） 4 μL，Primer ITS1 （10 ng/μL） 2 μL，Primer ITS4（10 ng/μL） 2 μL，DNA模板（50 ng/mL） 5 μL，Extaq酶（5 U/μL） 0.5 μL，ddH2O 31.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸2 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。回收目的片段，測(cè)序工作由華大基因（北京）有限公司完成。將所測(cè)序列使用MEGA 5.05中的Clustal W功能進(jìn)行相似序列的比對(duì)，同時(shí)采用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.3.3 發(fā)酵提取物清除DPPH自由基活力測(cè)定

①DPPH溶液的配制。準(zhǔn)確稱(chēng)取20 mg DPPH，用95%乙醇定容于250 mL容量瓶中，得到濃度為0.2 mmol/L DPPH，避光保存（0～4 ℃）備用；②樣品乙醇提取物準(zhǔn)備。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1 g的提取物，加入5 mL 95%乙醇，超聲波提取1 h，8 000 r/min離心取上清液即為樣品乙醇提取物。③DPPH自由基清除率的測(cè)定方法。樣品乙醇提物2 mL及0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL加入同一具塞試管中振蕩搖勻30 min后，測(cè)定在517 nm波長(zhǎng)的吸光值A(chǔ)i；測(cè)定2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液與2 mL 95%乙醇溶液混合后的吸光值A(chǔ)c；測(cè)定2 mL樣品乙醇提物與2 mL 95%乙醇溶液混合后的吸光度Aj，重復(fù)3次。根據(jù)公式SR=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%計(jì)算清除率SR[5]。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 所有的檢測(cè)都設(shè)置3次重復(fù)，數(shù)據(jù)通過(guò)Origin Pro 8（OriginLab Corporation，Northampton，USA）軟件進(jìn)行方程擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的菌落及顯微特性

根據(jù)目前的研究報(bào)道[6]，結(jié)合作者先前的研究，確定該分離菌株的生長(zhǎng)溫度為18 ℃。在活化培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后，與培養(yǎng)基接觸處的接種體萌生稀疏的菌絲（圖1A），隨后菌落慢慢形成，在培養(yǎng)30 d以后接種體變成黑褐色，菌落開(kāi)始隆起并生成黃褐色或灰白色褶皺，部分菌落的表面有多糖分泌出來(lái)（圖1B）。挑選生長(zhǎng)期的該菌株，制片進(jìn)行觀察，如圖1C和圖1D所示，F(xiàn)4539在固體培養(yǎng)條件下，氣生菌絲由初級(jí)菌絲出芽生長(zhǎng)形成次級(jí)菌絲，菌絲體無(wú)色，有隔膜，次級(jí)菌絲還可能再次分叉。在次級(jí)菌絲的頂端形成分生孢子梗，而后分生孢子梗頂端特化，逐漸生長(zhǎng)膨脹形成瓶梗結(jié)構(gòu)，瓶梗結(jié)構(gòu)可經(jīng)基部分裂形成分生孢子。這些特征與冬蟲(chóng)夏草菌（Cordyceps sinensis）的描述基本一致[7]。

2.2 菌株分子生物學(xué)鑒定

對(duì)該菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)（圖2），推測(cè)獲得的序列長(zhǎng)度為500～750 bp，基因測(cè)序由華大基因（北京）有限公司完成，其所測(cè)ITS序列長(zhǎng)度為616 bp，并提交GenBank生物數(shù)據(jù)庫(kù)，注冊(cè)登錄號(hào)為KU359775。通過(guò)對(duì)該序列進(jìn)行Blast比對(duì)，選擇與其相似性高的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建，如圖3所示。其中，F(xiàn)4539（KU359775）與Ophiocordyceps sinensis voucher HMAS 173835（EU570946）、Hirsutella sinensis L95DBM-1（AJ309355）和Cordyceps sinensis voucher L95D04（RZ）（AJ309354）具有99%的相似性。2005年10月29日，中國(guó)菌物學(xué)會(huì)在北京召開(kāi)了“冬蟲(chóng)夏草及其無(wú)性型研討會(huì)”，確認(rèn)冬蟲(chóng)夏草的學(xué)名是Cordyceps sinensi （Berk.） sacc.或Ophiocordyceps sinensis，其無(wú)性型是中華被毛孢（Hirsutella sinensis），異名有蝙蝠蛾多（被）毛孢（Hirsutella hepiali）、中華束絲孢（Synnematium sinense）。因此可以確定，F(xiàn)4539為冬蟲(chóng)夏草菌的無(wú)性型中華被毛孢（Hirsutella sinensis）。

2.3 冬蟲(chóng)夏草菌發(fā)酵物的抗氧化活性

對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌F4539的發(fā)酵提取物進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定，并與國(guó)產(chǎn)某商品化冬蟲(chóng)夏草菌菌絲體膠囊的提取物進(jìn)行抗氧化活性對(duì)比，結(jié)果（圖4）表明，冬蟲(chóng)夏草菌F4539發(fā)酵物20 g/L乙醇提取液的DPPH抗氧化活性為75.39%，明顯高于同濃度國(guó)產(chǎn)某商品提取物的抗氧化性的53.51%，這可能與處理工藝不同有關(guān)。本試驗(yàn)在樣品處理過(guò)程中使用低溫培養(yǎng)、冷凍干燥，極大地降低了抗氧化活性的損失。到目前為止，對(duì)冬蟲(chóng)夏草的抗氧化活性的研究已有大量的報(bào)道，大多數(shù)以野生冬蟲(chóng)夏草為研究材料，但對(duì)無(wú)性型菌株發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化研究較少[8，9]。

為了進(jìn)一步比較冬蟲(chóng)夏草菌F4539發(fā)酵物及國(guó)產(chǎn)某商品化冬蟲(chóng)夏草菌絲體膠囊乙醇提取物濃度與清除DPPH自由基能力的量效關(guān)系，以菌絲體20 g/L的乙醇提取物為基準(zhǔn)，按照2倍系數(shù)逐級(jí)稀釋獲得20.00、10.00、5.00、2.50、1.25、0.63、0.31、0.16 g/L的乙醇提取物，測(cè)其對(duì)DPPH自由基清除率。隨著乙醇提取物濃度的增加，冬蟲(chóng)夏草菌F4539發(fā)酵物及國(guó)產(chǎn)某商品化冬蟲(chóng)夏草菌絲體膠囊乙醇提取物對(duì)DPPH自由基清除率增強(qiáng)，F(xiàn)4539菌絲體提取物和商品化菌絲體膠囊DPPH清除率對(duì)濃度的響應(yīng)曲線如圖5所示，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度范圍內(nèi)，提取物清除自由基能力與濃度呈明顯的量效關(guān)系，其IC50分別為5.96和11.61 g/L，證明F4539發(fā)酵提取物的抗氧化活性優(yōu)于某商業(yè)化產(chǎn)品，具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的潛力。

3 結(jié)論

目前，對(duì)冬蟲(chóng)夏草發(fā)酵的研究主要集中在菌株篩選、發(fā)酵優(yōu)化和發(fā)酵產(chǎn)物活性評(píng)價(jià)及應(yīng)用幾個(gè)方面。其中確定菌株是否為冬蟲(chóng)夏草無(wú)性型中華被毛孢成為最關(guān)鍵的問(wèn)題之一。因此，在對(duì)冬蟲(chóng)夏草的研究之前對(duì)菌株進(jìn)行鑒定是很有必要的，而分子生物學(xué)方法是鑒定冬蟲(chóng)夏草無(wú)性型的最有效方法之一。本研究采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定手段證明菌株F4539（KU359775）為冬蟲(chóng)夏草菌的無(wú)性型中華被毛孢（Hirsutella sinensis）?？寡趸钚栽囼?yàn)表明，F(xiàn)4539菌絲體提取物和商品化菌絲體膠囊對(duì)DPPH清除率與濃度呈明顯的量效關(guān)系，其IC50分別為5.96 和11.61 g/L，證明F4539發(fā)酵提取物的抗氧化活性優(yōu)于某商業(yè)化產(chǎn)品。因此，冬蟲(chóng)夏草菌F4539具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的潛力。

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