乳鐵蛋白對大鼠上頜擴弓及復發過程中腭中縫骨改建的影響

程 燁 張 程 葛孟柯 李天成 陳建偉 李 煌

上頜骨橫向發育不足常常導致上頜牙弓狹窄、牙列擁擠、反牙合等正畸臨床中常見的錯牙合畸形。上頜擴弓是正畸治療中廣泛用于改善生長發育期兒童上頜骨橫向發育不足的手段[1]。雖然上頜擴弓可以顯著擴寬生長發育期兒童患者的上頜骨，去除擴弓裝置后的復發卻屢見不鮮[2]。如何提高上頜擴弓之后的穩定性、減少復發量一直是正畸醫生關注的臨床問題。

在上頜擴弓的過程中，腭中縫在應力牽張的作用下發生一系列的改建[3]，包括骨的改建和纖維組織的重新排列[4，5]。在上頜擴弓的應力刺激下，腭中縫區域的成骨量和破骨量同時增加，一般情況下成骨量的增加多于破骨[6]。去除擴弓裝置后，成骨和破骨活動未能處于動態的穩定狀態，成骨量不足或破骨量過多，是導致上頜擴弓后復發的主要原因[7]。臨床上常用的減少復發的方式是延長擴弓保持的時間，但這樣的方法不僅延長了矯治時間，降低患者的舒適度，更因為患者的配合問題常常不能得到理想的保持效果。故學者們試圖尋找一種更為積極的方式，通過增強上頜擴弓過程中的成骨活動和（或）抑制破骨活動來保持擴弓效果[8]。

乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）是一種鐵結合球狀糖蛋白，生理性存在于人體多種體液中，具有抗菌、免疫調節等多項生理功能。除此之外，LF在骨代謝中的作用也逐漸受到關注[9]。在近年來的研究中，LF被發現不僅可以增強成骨前體細胞的成骨分化、促進成骨細胞的增殖、防止其凋亡[10]，還對抑制破骨細胞生成、降低破骨活性起一定的作用。所以理論上LF 干預可能可以通過在上頜擴弓過程中調節腭中縫區域的骨改建來提高上頜擴弓的穩定性、減少復發。

與此同時，Hou 等[11]的研究發現LF 對大鼠骨質的改善作用與LF 的濃度有一定的正相關，即濃度更大的LF 有更好的改善骨質疏松的能力。Walli等[12]將LF 加入小鼠的骨髓細胞體外培養模型中，觀察顯示LF 只有在較高濃度下才可以抑制破骨細胞分化。故LF 對骨代謝的調節作用可能具有一定的計量依賴性[13]。

基于以上的發現和假設，本研究在Wistar 大鼠上頜擴弓及復發過程中采用不同濃度的LF 灌胃干預，以觀察這些濃度的LF 灌胃對大鼠上頜牙弓擴寬量、復發量以及其過程中腭中縫骨質的影響。

資料和方法

1.動物處理及分組

24 只5 周齡雄性Wistar 大鼠（成都達碩實驗動物有限公司，中國），體重100±10g，SPF 級，用相同的基礎飲食、飲水飼養。大鼠適應性飼養1 天后（D0），隨機分為3 組：單純擴弓組（EO），安裝擴弓裝置；擴弓+LF1 組（E+LF1），擴弓同時給予10mg/kg/d LF 溶液灌胃；擴弓+LF2 組（E+LF2），擴弓同時給予1g/kg/d LF 溶液灌胃；每組8 只大鼠。本研究動物實驗經四川大學華西口腔醫院動物倫理委員會審查批準。

用0.014 英寸澳絲彎制成有兩個平行臂的兩眼開大簧作為擴弓裝置（圖1A）。裝置兩臂對稱性打開（圖1B），測力計測得壓縮兩臂至平行時將產生100±5g 的對抗力，即初始擴弓力值。大鼠經腹腔注射10%水合氯醛溶液（3ml/kg體重）麻醉后，將擴弓裝置兩臂平行地安置在大鼠上頜兩側磨牙牙合面，使用Fuji ORTHO LC 光固化正畸粘接系統固定（圖1C）。

圖1 擴弓裝置及其在大鼠口內安裝

7天的擴弓后（D7），每組隨機挑選4 只大鼠處死并獲取腭部標本，其余大鼠去除口內裝置即進入復發階段。復發7 天后（D14），處死剩余的每組4 只大鼠并獲取腭部標本。

2.LF灌胃干預

用LF 粉（95%，Westland Milk products 公司，新西蘭）分別配置1mg/ml、100mg/ml 的LF 生理鹽水溶液。從D0 起，以1ml/100g 體重的標準每日定時分別給兩組大鼠灌胃：E+LF1 組使用1mg/ml LF 溶液，E+LF2 組使用100mg/ml LF 溶液；EO 組用等量的生理鹽水灌胃。

3.牙弓寬度測量

在D0 安置裝置前、D7 處死大鼠前或除去裝置后、D14 處死大鼠前分別使用游標卡尺在大鼠口內測量大鼠上頜兩側第一磨牙腭側齦緣間的距離。

4.標本獲取及處理

大鼠采用過量麻醉配合斷頸的方式處死，剪下其上頜骨并置于4%多聚甲醛溶液中，于4℃固定48 小時后的標本洗凈即用于Micro-CT 掃描、分析。用于HE 染色的標本固定、洗凈后置于10%EDTA脫鈣液中脫鈣。之后，標本脫水、浸蠟，進行常規石蠟包埋。在大鼠第一磨牙范圍內，垂直于腭中縫長軸對組織塊進行切片，得到3μm 厚的連續切片。

5.Micro-CT檢測

標本置于Micro-CT 掃描管中，在Micro-CT 掃描儀（Scanco Medical 公司，瑞士）載物臺上進行掃描，掃描相關參數為：電壓90kV，電流50μA，投影數450，分辨率10μm。

用VG Studio Max 軟件（Volume Graphics 公司，德國）對掃描的上頜骨及上頜牙列進行三維重建和分析。研究分析的感興趣區域位于大鼠上頜第一磨牙近遠中根尖孔間的腭中縫區域，其橫向延伸至腭中縫骨邊界兩側各200μm 的范圍（圖2AB）。利用軟件的“壁厚分析”功能描繪感興趣區域內的腭中縫兩側骨壁，并測量兩骨壁之間的距離作為腭中縫寬度（圖2CD）。感興趣區域的其他測量參數還包括：骨體積分數（BV/TV），骨小梁數目（TbN），骨小梁厚度（TbTh），骨小梁間隙（TbSp），校正平均灰度（MGS）。為消除誤差，用測量出的MGS 除以每個標本的灰度閾值，即得到校正后的MGS，本文后續描述中將直接用MGS 表示。

6.HE染色

石蠟切片脫蠟、水洗，依次經歷蘇木素染液染色、鹽酸酒精分色、氨水返藍以及伊紅染液染色后置于普通光學顯微鏡下觀察。

7.統計學分析

圖2 Micro-CT 分析

實驗所得量化結果均以平均數±標準差的形式表示，使用SPSS 軟件對兩個時間點（D7、D14）之間的數據進行t檢驗比較；對三個實驗分組或三個時間點（D0、D7、D14）之間的數據進行單因素方差分析以及Tukey’s 檢驗。P＜0.05 則被認為有統計學差異。

結 果

1.牙弓寬度變化情況

牙弓寬度的測量結果顯示，D0 和D7 時3 組大鼠的牙弓寬度都沒有統計學差異。經過7 天的復發期后，D14 時EO、E+LF1 兩組大鼠的牙弓寬度與擴弓結束時相比有明顯的下降；而E+LF2 組D14 的牙弓寬度明顯大于其余兩組，且與其在D7 的牙弓寬度相比沒有顯著下降（圖3）。

圖3 牙弓寬度變化情況

2.Micro-CT測量分析結果

（1）腭中縫寬度：擴弓結束時，三個組的腭中縫寬度測量值數據沒有統計學差異。D14 時EO、E+LF1 組的腭中縫寬度基本一致，而E+LF2 組腭中縫顯著窄于EO 組（圖4A）。

（2）BV/TV：在D7、D14 兩個時間點，E+LF1 組的BV/TV 稍大于EO 組，但兩者之間沒有明顯差異。E+LF2 組的BV/TV在兩個時間點都顯著大于EO 組（圖4B）。

（3）骨小梁參數：E+LF2 組的TbN在D7 和D14都顯著大于EO 組。在兩個時間點，EO、E+LF1 兩組之間的TbN 沒有統計學差異（圖4C）。三個實驗組在整個實驗期間TbTh 測量值都沒有明顯差異（圖4D）。于兩個觀測時間點，EO、E+LF1 兩組的TbSp 都沒有統計學差異，而TbSp在E+LF2 組則顯著低于EO 組（圖4E）。

（4）校正MGS D7、D14 時，E+LF1 組腭中縫骨質的MGS 稍大于EO 組，但兩者間沒有統計學差異；E+LF2 組的MGS 測量值在兩個時間點都明顯大于EO 組（圖4F）。

圖4 Micro-CT 測量分析結果

3.HE染色

與EO 組相似，LF 灌胃干預的兩組大鼠腭中縫在D7 也可見明顯向兩側擴展的軟骨層，其間的纖維組織受到牽拉，中縫區域有明顯的骨膜細胞、成骨樣細胞的遷移和聚集，腭骨骨端的邊緣可見新骨的沉積；7 天的復發期后，LF 灌胃干預組大鼠腭中縫也經過進一步改建，隨骨端邊緣新骨的繼續形成和骨膜下細胞的進一步聚集，原先的軟骨結構基本消失（圖5）。

與EO組不同的是：LF 灌胃干預的兩組大鼠D7 時腭中縫可見更多的新骨形成；在D14 這兩組大鼠的腭中縫也可見更多的粉紅色新骨沉積，以及更多的骨膜細胞、成骨樣細胞聚集（圖5）。

圖5 HE 染色

三組大鼠的HE 染色中均未見明顯的炎癥反應。

討 論

近年來LF在骨代謝中的作用逐漸受到關注[9]。成骨作用方面，LF 被發現不僅可以增強成骨前體細胞的成骨分化、促進成骨細胞的增殖，還可以防止成骨細胞的凋亡[14～16]。將成骨細胞種植在富含LF 的涂層材料上，可以檢測到成骨細胞的黏附、增殖和分化都有顯著的增強[10]。破骨作用方面，LF 被證明對抑制破骨細胞生成、降低細胞破骨活性等方面起一定的作用[16]。LF 添加入小鼠骨髓細胞培養基可以明顯減少新分化的破骨細胞數量[9]。

與此同時，LF 對成骨、破骨方面的作用與其作用濃度密切相關。以往的研究表明，在體內，LF 對去勢大鼠的骨質改善作用呈明顯的劑量依賴性[13]；在體外，只有高濃度的LF 才能抑制破骨前體細胞的破骨向分化[12]。Yoshimaki 等[17]制造大鼠的顱骨缺損模型，分別給大鼠10mg/kg 體重、100mg/kg 體重的LF 腹腔注射。結果發現100mg/kg 體重LF 注射組在顱骨缺損處可以觀察到更多的成骨樣細胞聚集，有更多的骨修復。另一項給予去勢大鼠不同濃度的LF灌胃的研究，LF 濃度梯度從10mg/kg 體重到2g/kg體重不等。結果表明LF 對大鼠骨質的改善作用呈一定的計量依賴性，且只有LF 濃度達到1g/kg 體重及以上時才對破骨活動有抑制作用[11]。因此，為研究不同濃度LF 灌胃對大鼠上頜擴弓及復發過程中腭中縫骨改建的影響，我們設定的LF 灌胃濃度為10mg/kg 體重和1g/kg 體重。

HE 染色結果提示，在大鼠腭中縫正常骨改建的基礎上，LF 灌胃干預的兩組大鼠中縫兩端的骨板邊緣有更多的新骨形成；在機械應力之后的骨改建階段LF 灌胃干預的兩組大鼠腭中縫有更多的骨膜細胞、成骨樣細胞聚集。可能是LF 作用導致的這些有成骨潛力的細胞向腭中縫區域遷移，或者LF 促進了這些細胞的增殖。這可能是LF 灌胃組大鼠腭中縫更多新骨形成的原因。

Micro-CT 測量分析結果顯示，E+LF2 組的腭中縫寬度在D14 顯著小于EO 組，這可能是因為在機械牽張力結束后，大鼠腭中縫發生進一步的組織改建，而E+LF2 組大鼠在中縫兩側的骨端表面有更多的骨質沉積。BV/TV 測量、MGS 測量都顯示E+LF2在D7、D14 兩個時間點的測量值都顯著大于EO組。這表明了1g/kg 體重的LF 灌胃導致了大鼠腭中縫骨質的致密程度在兩個時間點都被明顯的增強了。而相比于EO 組，E+LF2 組的骨小梁參數TbN 測量值顯著增加、TbSp 的測量值顯著下降則提示在高濃度LF 灌胃的作用下大鼠腭中縫的骨小梁變得多而排列緊密。

有趣的是，組織學檢測發現的E+LF1 組大鼠腭中縫更多的新骨形成并沒有體現在Micro-CT 的檢測結果中。以往的研究中也曾出現二者檢測結果不一致的情況：Yoshimaki 等[17]探究LF 對骨質的修復作用時，低濃度的LF 干預組組織學染色觀察到成骨細胞的增多、成骨效應的增強，而Micro-CT 檢測結果卻顯示與對照組沒有顯著差異，即沒有體現出組織學的改變。由此可以推測，E+LF1 組可能由于LF 的灌胃濃度較低，所產生的增強成骨活動的效應較弱，所以導致組織學的改變不足以帶來Micro-CT可以檢測到的宏觀的改變。除此之外，牙弓寬度的變化則是衡量LF 對上頜擴弓及復發的影響更為宏觀且最具臨床意義的測量指標。本實驗大鼠牙弓寬度的測量顯示：三個實驗組大鼠的牙弓寬度基線是一致的，擴弓7 天后4 組大鼠的上頜擴弓量也沒有顯著差異；經過7 天的復發期后，EO、E+LF1 兩組大鼠的牙弓寬度出現了明顯的復發，而E+LF2 組則較好的保持了上頜擴弓后的牙弓寬度。這樣的結果表明1g/kg 體重的LF 灌胃不能增加上頜擴弓的擴弓量，但可以較好的保持擴弓的效果，維持上頜擴弓的穩定性。

綜上所述，LF 灌胃可以在大鼠上頜擴弓及復發的過程中促進腭中縫的新骨形成，并呈一定的計量依賴性；高濃度LF 灌胃可以在大鼠上頜擴弓及復發的過程中增強腭中縫的骨質，減少上頜擴弓的復發量，維持上頜擴弓的穩定性。