CEACA M6與MMP-9在口腔鱗癌中的表達與臨床意義

楊海燕 王 巍 賽音烏力吉 閆 冰 張連齊 李吉辰

口腔鱗癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，雖然放化療和手術治療已經大大提高了鱗癌患者的生存率，但是總體生存率也只能達到50%左右，并且發病率逐年上升[1～3]。隨著對口腔鱗癌不斷的深入研究，靶向治療逐漸成為口腔鱗癌綜合治療的重要組成部分。癌胚抗原相關細胞黏附分子6（CEACAM6）為免疫球蛋白超家族的重要成員，是非特異性的交叉抗原[4]。CEACAM6 的相互交聯還可通過升高c-Src 活性而增加腫瘤細胞黏附于細胞外基質[5]，在腫瘤轉移和侵襲中發揮作用。CEACAM6在多種實體腫瘤，如肺癌、胰腺癌、胃腸腫瘤、乳腺腫瘤和卵巢癌等表達升高[6]。基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）主要功能是可以突破細胞外基質及基膜，促進腫瘤向遠處侵襲轉移[7]。相關研究表明，CEACAM6 可通過MMP9 信號通路促進EMT 的發生，從而促進腫瘤的侵襲轉移[8]；本實驗通過研究CEACAM6 和MMP-9在口腔鱗癌中的表達的關系，為口腔鱗癌的治療提供新的靶點。

資料和方法

1.材料：口腔鱗癌組織石蠟標本選取于哈爾濱醫科大學第一臨床醫院病理科，選擇2011年3月至2012年9月期間70 例患者為觀察組，其中男性39例，女性31例；年齡在39～80 歲，平均年齡55 歲。分化程度：高分化51例，中低分化19 例。另取30例正常口腔黏膜組織石蠟標本作為對照組。據病例資料顯示，所有患者術前均未行放、化療等治療，且70 例患者均采取口腔鱗癌病灶切除術加頸部淋巴結清掃術。根據國際抗癌聯盟（UICC）2010年制訂的TNM 分期標準對口腔鱗癌進行臨床分期[9]，其中Ⅰ～Ⅱ期42 例，Ⅲ～Ⅳ期28 例。

2.主要試劑：CEACAM6 兔抗人多克隆抗體（北京博奧森生物工程有限公司）、MMP-9 兔抗人多克隆抗體（北京博奧森生物工程有限公司）、免疫組化試劑盒（武漢博士德生物有限公司）、DAB 顯色試劑盒（武漢博士德生物有限公司）。

3.免疫組織化學檢測：將組織石蠟切片置于67℃烤箱中烤90min，脫蠟，PBS 沖洗3min×3 次。3% H2O2室溫下孵育10min，PBS 沖洗3min×3 次。PBS 浸泡5min。將切片浸泡于EDTA 緩沖液，高壓蒸汽鍋行抗原修復，待壓力鍋噴氣時，計時3min 后室溫下自然冷卻。PBS 沖洗5min×3 次。滴加CEACAM6（1:100）及MMP-9 多克隆抗體（1:100），4℃恒溫環境下過夜，蒸餾水沖洗5min 后PBS 沖洗3min×3 次；滴加二抗工作液，37℃孵育30min;蒸餾水沖洗3min 后PBS 沖洗3min×3 次；DAB 試劑盒顯色，蒸餾水沖洗終止顯色反應。蘇木精復染，蒸餾水充分沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。

4.結果判斷：CEACAM6 和MMP-9在口腔鱗癌組織中的抗原陽性表達均為細胞質被染出棕黃色顆粒，亦少見細胞膜表達。每張切片隨機觀察5 個高倍鏡不重疊視野（×400），每個視野計數200 個細胞。用雙盲法，以陽性細胞率及染色強度行半定量評分，陽性細胞率以≤10%、＞10%～50%、＞50%～80%、＞80%分別記為0、1、2、3 分；按染色程度評分：無染色為0 分、淺黃色為1 分、棕黃色為2 分、棕褐色為3 分；按兩者的得分之積來判定結果：＜3 分計為陰性（-），≥3 分計為陽性（+）。

5.統計學處理：本實驗采用SPSS 20.0 統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，Spearman 法行等級相關分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.CEACAM6和MMP-9在口腔鱗癌及正常口腔黏膜組織中的表達比較：CEACAM6 和MMP-9在口腔鱗癌中的表達均主要位于胞質中，癌細胞亦都被染成棕褐色，少見細胞膜表達。而兩者在正常口腔黏膜組織中低表達或不表達（圖1）。CEACAM6在口腔鱗癌組織中陽性表達率分別為71.43%（50/70），MMP-9 則為74.29%（52/70），在正常口腔黏膜組織中陽性表達率分別為16.67%（5/30）、13.33%（4/30）。兩者在觀察組中的陽性表達率均明顯高于正常口腔黏膜組織（P＜0.05），見表1。

表1 CEACAM6和MMP-9在口腔鱗癌及正常口腔黏膜組織中的表達

2.口腔鱗癌組織中CEACAM6 及MMP-9 的表達與患者臨床病理參數的關系

3.口腔鱗癌組織中CEACAM6 和MMP-9 表達的相關性：70 口腔鱗癌組織中CEACAM6 陽性表達的有50 例（MMP-9 陽性44 例，陰性6 例），CEACAM6 陰性表達的有20 例，（MMP-9 陽性6例，陰性12 例）。經Spearman 等級相關性分析，兩者間的表達呈明顯正相關（r＝4.712，P＜0.05），見表3。

表2 CEACAM6、MMP-9 的表達與口腔鱗癌臨床病理參數的關系

表3 CEACAM6和MMP-9在口腔鱗癌組織中表達的相關性

討 論

CEACAM6 為免疫球蛋白超家族的重要成員，是非特異性的交叉抗原，通過糖基磷脂酰肌醇連接在細胞膜上[10]。CEACAM6 屬于信號傳導通路的下游基因，它的表達產物位于細胞漿內，通過轉錄和中介調節因子共同促進腫瘤發生。它的表達在腫瘤前期病變中升高，可能作為腫瘤癌變的重要標志物[11]。研究表明，CEACAM6在正常組織中不表達或低表達，在惡性上皮細胞腫瘤（如胃腸道腫瘤、胰腺癌、肺癌、乳腺癌）中普遍表達增高[12～13]，但目前CEACAM6在口腔鱗癌中的表達尚未有相關報道。Katayama[14]等報道的研究結果表明：MMP-9 的表達水平反應了口腔鱗癌的轉移能力，它的過度表達使細胞外基質和基底膜被降解和破壞，腫瘤細胞得以向淋巴管內浸潤，造成腫瘤的轉移。因此，MMP-9 的表達與腫瘤的侵襲和轉移有關，可作為判斷口腔鱗癌侵襲和轉移潛能的生物學標志之一。

本實驗研究中，觀察組中CEACAM6 的陽性率為71.43%，對照組為16.67%，CEACAM6在口腔鱗癌中的表達遠高于在正常組織中的表達。同時發現CEACAM6 的高表達與年齡（P＝0.513）、性別（P＝0.236）及腫瘤大小（P＝0.235）無關，而與口腔鱗癌的組織分化程度（P＝0.006）及TNM 分期（P＜0.001）有關，且CEACAM6 表達越高，惡性腫瘤分化程度越高，推測CEACAM6 可能作為評估口腔鱗癌的分化程度的一個重要指標，并且有望在臨床上成為口腔鱗癌的標志物。目前的研究表明[15]，在腫瘤組織中，CEACAM6 主要通過打破組織結構，影響細胞極性及分化，抗腫瘤細胞失巢凋亡，增加腫瘤侵襲、轉移能力，從而促進腫瘤的發生、發展。

本實驗中，口腔鱗癌組織中MMP-9 的陽性表達率為74.29%，正常組織陽性表達率為13.33%，表明MMP-9在口腔鱗癌中高表達，并且MMP-9 的表達與年齡（P＝0.253）、性別（P＝0.082）及腫瘤大小（P＝0.066）無關，與口腔鱗癌的組織分化程度（P＝0.01）及TNM 分期（P＝0.003）有關。在正常組織中MMP-9 通過酶解作用，維持細胞外基質中膠原合成與分解之間的平衡。在腫瘤組織中MMP-9 的過量表達不但可以降解基底膜和細胞外基質中的Ⅳ型膠原，還可以促進腫瘤周圍微血管的生長。口腔鱗癌細胞中基質降解酶的產生可直接影響腫瘤的轉移能力;腫瘤細胞分泌MMP-9 的差異反映了腫瘤個體侵襲轉移能力的不同。因此，MMP-9 不僅可作為口腔鱗癌的腫瘤標志物，而且還可作為評估口腔鱗癌浸潤、轉移的重要指標。

CEACAM6 可通過MMP9 信號通路促進EMT的發生，從而促進腫瘤的侵襲轉移；也可以通過c-src 途徑避免腫瘤失巢凋亡，同時有效降低腫瘤細胞中E-cadherin 的表達，使腫瘤的侵襲能力明顯增強[16]。Chen 等[17]在胰腺癌的研究中發現，CEACAM6能夠通過介導EMT 促進胰腺癌的發生、發展，在進一步的動物實驗中也驗證了這一點[18]。同樣，在胃癌的研究中也得出了相似的結論[19]：CEACAM6 增加了金屬基質蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）的活性，而金屬基質蛋白酶被認為有促進EMT 形成的作用；同時，研究還發現CEACAM6 可增加AKT 磷酸化的水平并能被PI3K 的阻斷劑逆轉產生間質向上皮轉化（mesenchymal-epithelial transition，MET） 改變。以上這些研究表明CEACAM6 可能通過MMP-9、PI3K/AKT 信號通路促進了EMT 的發生，從而增強了腫瘤侵襲和轉移。本實驗研究結果顯示：CEACAM6 和MMP-9在口腔鱗癌中的表達呈正相關（r＝4.712，P＝0.0001），實驗結果與現已有研究結果一致，CEACAM6與MMP-9密切相關，并相互作用，促進腫瘤細胞的轉移侵襲。

綜上所述，本研究結果表明CEACAM6 和MMP-9與口腔鱗癌的發生、發展及遠處轉移密切相關，二者可作為口腔鱗癌的早期診斷的重要指標，評估腫瘤的轉移能力及預后，為口腔鱗癌的治療提供新的思路和途徑。