紅芽直立茶紫色葉形成機(jī)制的轉(zhuǎn)錄組分析

劉 悅，曲 浩，李友勇，段志芬，楊盛美，尚衛(wèi)瓊，矣 兵，楊興榮，孫雪梅，劉本英

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，云南省茶學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 勐海 666201）

茶樹(shù)（Camellia sinensis）是被子植物山茶科的成員，葉片用于生產(chǎn)多種茶葉[1]。茶是世界上最受歡迎的飲料之一，它含有許多次級(jí)代謝產(chǎn)物，使得茶葉具有豐富的味道，并且對(duì)人類(lèi)健康有益處[2]。因?yàn)椴铇?shù)的性狀和應(yīng)用非常多樣化，得以在世界范圍內(nèi)廣泛栽培[3]。在長(zhǎng)期自然雜交和人工選擇壓力下，茶樹(shù)芽葉的顏色變得非常豐富[4]，是茶感官評(píng)價(jià)中的重要組成部分。中國(guó)具有豐富的茶樹(shù)種質(zhì)資源，除了常見(jiàn)的濃綠色芽葉以外，還有黃綠、紅褐和紫褐色等其他顏色。紅芽直立茶（Camellia assamica cv.Hongya zhili tea）是云南特有的茶樹(shù)種質(zhì)資源，原產(chǎn)于云南景谷，其典型特征為大葉，芽葉深紫紅色，莖紫紅色，花青素含量高。紅芽直立茶和紫色芽、莖、葉的“紫鵑”相類(lèi)似，但紫色的葉子不會(huì)隨著葉片的生長(zhǎng)和發(fā)育而逐漸變綠[5]，可以一直保持紫色。這些茶樹(shù)品種是生產(chǎn)具有特定顏色和風(fēng)味的獨(dú)特茶葉的寶貴材料，對(duì)未來(lái)整個(gè)茶業(yè)都是有利的。

植物葉片具有各種顏色是色素積累的綜合結(jié)果，植物中普遍存在的色素包括葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素和類(lèi)黃酮[6]。花青素屬于類(lèi)黃酮化合物，到目前為止，已經(jīng)在許多水果、蔬菜和花卉中發(fā)現(xiàn)了超過(guò)635種花青素[7]，是植物科學(xué)中研究最多的化合物之一，其代謝途徑已被多次描述?；ㄇ嗨匮苌镏械娘w燕草色素、牽牛花色素和錦葵色素是植物紫色和深色的來(lái)源，而矢車(chē)菊色素和天竺葵色素是鮮紅色果實(shí)中的主要色素[8]?；ㄇ嗨夭坏梢允谷~色發(fā)生變化，還可以導(dǎo)致生理生化過(guò)程的改變[4]，例如增加植物的抗性?；ㄇ嗨乜杀Ｗo(hù)植物免受各種生物和非生物脅迫，包括冷脅迫[9]、鹽脅迫[10]和低磷脅迫[11]。茶樹(shù)紫色葉中的花青素具有多種與健康相關(guān)的生物功能，如作為抗氧化劑、抗菌劑[12]和降低血脂[13]。因此，紫芽茶樹(shù)是茶樹(shù)育種中的重要資源，目前已經(jīng)選育出許多具有紅紫色芽葉的茶樹(shù)品種，例如“武夷奇種”[14]、“紫鵑”[5]和“紫燕”[15]。

盡管已經(jīng)鑒定出了幾種與花青素生物合成和調(diào)節(jié)有關(guān)的基因，但是對(duì)每種花青素生物合成途徑調(diào)控的機(jī)制仍然不是很清楚。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，使得利用大規(guī)?；虮磉_(dá)數(shù)據(jù)集對(duì)花青素生物合成及其調(diào)控基因的功能研究成為現(xiàn)實(shí)。RNA測(cè)序（RNA-Seq）的易用性和高效性有助于研究代謝物變異的機(jī)制，轉(zhuǎn)錄組學(xué)已成功應(yīng)用于研究植物代謝機(jī)制[16]和基因在組織發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控功能[6]。本研究中，我們?cè)谵D(zhuǎn)錄組水平上分析了同一株茶樹(shù)上兩種不同顏色葉片之間的差異表達(dá)基因及其功能，探索茶樹(shù)紫色葉中花青素和類(lèi)胡蘿卜素的生物合成及其調(diào)控機(jī)制。研究結(jié)果增加了我們對(duì)茶樹(shù)紫色葉中與色素積累相關(guān)的生物合成基因和相關(guān)調(diào)節(jié)因子的理解，對(duì)未來(lái)特色茶樹(shù)品種的選育具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究使用的實(shí)驗(yàn)材料為紅芽直立茶的一芽三葉，采集于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所國(guó)家種質(zhì)大葉茶樹(shù)資源圃（勐海）。在同一株茶樹(shù)上分別采摘紫色和綠色的茶葉，用錫紙包好之后立即放入液氮速凍，-80℃冰箱保存。每種樣品準(zhǔn)備3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 建庫(kù)測(cè)序

使用 TRIzol試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）分別提取每個(gè)樣品的總RNA。使用DNaseI處理檢測(cè)合格后的總RNA，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集其中的mRNA，將mRNA打斷后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Illumina TruSeq RNA樣品制備試劑盒第2版（Illumina，San Diego，CA，USA）制備RNA-seq配對(duì)末端文庫(kù)。使用Illumina HiSeq 4000測(cè)序平臺(tái)完成測(cè)序，建庫(kù)測(cè)序在北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.3 新基因預(yù)測(cè)

使用cufflinks（2.2.1）軟件組裝新的轉(zhuǎn)錄本，再利用cuffmerge對(duì)多個(gè)樣品的組裝結(jié)果進(jìn)行合并，并過(guò)濾可能為人工引入的組裝錯(cuò)誤的轉(zhuǎn)錄本生成唯一注釋文件供后續(xù)差異分析使用。Cuffcompare將組裝的轉(zhuǎn)錄本根據(jù)與參考文件在基因組上的位置關(guān)系分為十二類(lèi)，其中classcode為u（未知的，基因間區(qū)的轉(zhuǎn)錄本）即認(rèn)定為新基因。以Length>=200bp且exon number>=2作為可靠的新基因篩選條件，并對(duì)新基因進(jìn)行功能注釋。

1.4 基因表達(dá)與富集分析

首先對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，去除含有接頭和低質(zhì)量的序列。使用Tophat 2（2.1.1）軟件將clean reads比對(duì)到茶樹(shù)的參考基因組[1]上，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品中每個(gè)基因比對(duì)到其位置上的read count數(shù)目，并計(jì)算其FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads）值。使用edgeR軟件分析紫色和綠色葉中的基因表達(dá)差異，然后使用R程序中的GOseq包對(duì)差異基因 （DEGs）進(jìn)行GO富集分析，使用KOBAS（2.0）對(duì)DEGs進(jìn)行Pathway富集分析，同時(shí)使用超幾何分布檢驗(yàn)的方法分析富集的顯著性。

1.5 RT-qPCR驗(yàn)證

通過(guò)熒光定量PCR（RT-qPCR）對(duì)RNA-seq的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)每個(gè)顏色的三個(gè)生物學(xué)重復(fù)的樣本都進(jìn)行PCR，且每個(gè)樣品都進(jìn)行三次技術(shù)重復(fù)。使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，通過(guò)TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS反轉(zhuǎn)錄試劑盒（艾德萊）和SYBR Green I進(jìn)行qPCR反應(yīng)，所使用的qPCR儀為qTOWER2.2型熒光定量PCR儀。通過(guò)茶樹(shù)的肌動(dòng)蛋白基因（actin）作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt的方法計(jì)算每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果和分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

為了解茶葉顏色多態(tài)性的分子基礎(chǔ)，將紫色和綠色葉共6份樣品（每個(gè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)）進(jìn)行高通量測(cè)序。紫色葉轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共得到141,279,238條高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，綠色葉共得到130,780,196條高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。高質(zhì)量數(shù)據(jù)均超過(guò)6G，來(lái)自配對(duì)末端讀數(shù)的Q20百分比（測(cè)序錯(cuò)誤率＜1%的序列百分比）均在98%以上，Q30都不低于94%（表1），說(shuō)明各樣品的測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量好、可信度高，能滿足后續(xù)數(shù)據(jù)分析的需求。測(cè)序得到的clean data上傳至NCBI的SRA（Short Read Archive）數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取號(hào)為SRP189546。

表1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計(jì)Table 1 Quality statistics of cleandata

2.2 不同顏色茶葉差異表達(dá)基因

為了分析不同顏色茶葉中的差異基因，我們首先對(duì)所有基因進(jìn)行定量。然后使用FDR＜0.05且|log2FC|>1作為差異基因（DEG） 的篩選條件，以綠色葉為對(duì)照，在紫色葉中一共有8779個(gè)基因是差異表達(dá)的，其中有6936個(gè)基因上調(diào)，1843個(gè)基因下調(diào)（圖1A）。分別從紫色和綠色的葉片中選取表達(dá)量最高的50個(gè)基因進(jìn)行基因表達(dá)模式分析，從圖1B中可以看出，這些基因的表達(dá)模式分為兩種。紫色葉中的基因與綠色相比，大多數(shù)基因的表達(dá)量上調(diào)?；跇?biāo)準(zhǔn)基因名和同義詞在差異基因的功能中進(jìn)行搜索，分析與植物色素積累有關(guān)的三個(gè)代謝途徑（類(lèi)黃酮生物合成，花青素生物合成，黃酮和黃酮醇生物合成途徑）的差異基因（表2）。

圖1 紫色和綠色葉中差異表達(dá)的基因Fig.1 Differentially expressed genes in purple and green leaves

表2 與茶葉色素積累相關(guān)的候選基因Table 2 Candidate genes related to tea pigment accumulation

2.3 差異表達(dá)基因的功能富集

得到差異基因之后，對(duì)差異基因進(jìn)行GO和KEGG Pathway富集分析。如圖2所示，GO數(shù)據(jù)庫(kù)把基因的本體分為三種：物過(guò)程（Biological Process,BP）、細(xì)胞組成（Cellular Component,CC）和分功能（Molecular Function,MF）。紫色葉與綠色葉比較，富集到差異基因數(shù)目最多的是分子功能，富集到差異基因數(shù)目最多的功能是結(jié)合與催化活性，其中尤其與糖基水解酶活性、葡萄糖苷酶活性和氧化還原酶活性相關(guān)的功能富集最顯著（表3）。富集到生物過(guò)程的差異基因主要集中在細(xì)胞過(guò)程和代謝過(guò)程中，其中最顯著富集的功能集中在細(xì)胞生長(zhǎng)、碳水化合物代謝和激酶活性三方面。我們還注意到其中的GO:0043473、GO:0043476、GO:0043478、GO:0043479和GO:0043480五條term都屬于組織中色素積累過(guò)程（表3）。

2.4 黃酮和花青素代謝對(duì)茶葉顏色的調(diào)控

圖2 差異基因GO功能二級(jí)分類(lèi)統(tǒng)計(jì)Fig.2 Secondary classification statistics of GO function of differential gene

表3 顯著富集的GO條目Table 3 GO items of significant enrichment

通過(guò)KEGG pathway富集分析，紫色葉與綠色葉相比，富集到的通路主要有氨基糖和核糖代謝、黃酮代謝、次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成，代謝途徑，苯丙烷類(lèi)生物合成、淀粉和蔗糖代謝（圖3A）。以富集到的黃酮代謝和花青素合成途徑為基礎(chǔ)，結(jié)合文獻(xiàn)構(gòu)建花青素在茶葉中的合成路徑（圖3B），以期找出調(diào)控茶葉顏色變化的關(guān)鍵基因。對(duì)途徑中的核心基因進(jìn)行了詳細(xì)分析，結(jié)果表明大多數(shù)基因的表達(dá)水平發(fā)生了顯著變化，無(wú)論它們是早期基因（查爾酮異構(gòu)酶CHS等）還是晚期基因 （花青素合酶ANS，葡糖基轉(zhuǎn)移酶UFGT等），它們?cè)谧仙~中的基因表達(dá)豐度均高于綠色葉（圖3C）。這些化合物和花青素的生物合成共有的常見(jiàn)酶促步驟由查爾酮合成酶（CHS），黃烷酮3'-羥化酶（F3'H），類(lèi)黃酮3'5'-羥化酶（F3'5'H）等催化。眾所周知，CHS催化花青素生物合成的第一反應(yīng)，并有助于形成中間體查爾酮，這是所有類(lèi)黃酮的主要前體。二氫黃酮還原酶（DFR）催化二氫黃酮醇生成各種無(wú)色的花色素，是花青素合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，ANS催化無(wú)色花青素變成有顏色的花青素，UFGT使花色苷的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。在花青素生物合成過(guò)程中涉及的所有基因中，有6個(gè)CHS、1個(gè)DFR、2個(gè)F3'5'H和2個(gè)ANS基因在紫色葉中的表達(dá)量顯著上調(diào)。通過(guò)甲基化、?；⒘u基化與糖基化等方式對(duì)植物中的花青素碳骨架進(jìn)行修飾，不同的修飾反應(yīng)可以形成不同的花青素?；ㄇ嗨靥腔D(zhuǎn)移酶（GT）決定了糖基的位置，在茶葉中主要是第3位糖基化的修飾酶UFGT（3GT），這也是共有的修飾步驟。與綠色葉相比，這也是花青素生物合成途徑中唯一一個(gè)出現(xiàn)下調(diào)的基因，說(shuō)明紫色葉中的花青素糖基化可能受到了抑制。

2.5 類(lèi)胡蘿卜素生物合成與茶葉紅色和黃色色素的積累

類(lèi)胡蘿卜素在植物中具有重要的生物學(xué)意義，β-胡蘿卜素在深色的植物中廣泛存在。八氫番茄紅素是植物中的第一個(gè)類(lèi)胡蘿卜素，經(jīng)過(guò)八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）和ζ胡蘿卜素脫氫酶 （ZDS）等酶經(jīng)過(guò)多步反應(yīng)催化脫氫后形成番茄紅素。番茄紅素經(jīng)ε-環(huán)化酶（lcyE）作用形成δ-胡蘿卜素，再經(jīng)lcyB催化形成α-胡蘿卜素。番茄紅素還可以通過(guò)β-環(huán)化酶（lcyB）作用形成β-胡蘿卜素，進(jìn)而通過(guò)β-環(huán)羥化酶 （LUT5）催化形成β-隱黃質(zhì)和玉米黃素，玉米黃素又在玉米黃素環(huán)氧化酶（ZEP）的催化下形成環(huán)氧玉米黃素和紫黃質(zhì)（圖4A）。在茶葉中發(fā)現(xiàn)許多編碼類(lèi)胡蘿卜素生物合成的關(guān)鍵酶基因，如PDS和lcyB在紫色葉中都是下調(diào)的，而LUT5是上調(diào)的，九順式環(huán)氧類(lèi)胡蘿卜素雙加氧酶（NCED）的多個(gè)拷貝上調(diào)與下調(diào)現(xiàn)象均有存在 （圖4）。PDS和lcyB基因在紫色葉中的下調(diào)表明番茄紅素的合成受到抑制，LUT5的上調(diào)則說(shuō)明β-胡蘿卜素的分解加強(qiáng)了，可以推測(cè)紫色葉中含有較低的番茄紅素和β-胡蘿卜素。在紫色葉中下調(diào)的ZEP和NCED之間的平衡表明紫黃質(zhì)的減少，這些變化說(shuō)明紫色葉的變黃衰老過(guò)程得到減緩。

圖4 茶葉中類(lèi)胡蘿卜素生物合成及其關(guān)鍵基因Fig.4 Carotenoid biosynthesis and its key genes in tea

2.6 茶葉中基因表達(dá)水平的驗(yàn)證

以茶樹(shù)的肌動(dòng)蛋白基因actin作為內(nèi)參基因，對(duì)參與茶樹(shù)黃酮和類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑中的關(guān)鍵基因CSA004930（F3H）、CSA011508（ANS）、CSA018076（UFGT）、CSA003404（ NCED）、CSA029707（CHI）、CSA024718（CHS）和CSA031792（F3'5'H）進(jìn)行了驗(yàn)證。使用2-ΔΔCt計(jì)算qRT-PCR的結(jié)果，驗(yàn)證的7個(gè)基因中，紫色葉和綠色葉相比，有5個(gè)上調(diào)，2個(gè)下調(diào)（圖5），與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)這些基因的表達(dá)模式與轉(zhuǎn)錄組中高度一致，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。

3 討論

圖5 差異表達(dá)基因的QRT-PCR結(jié)果Table 5 Verification of the expression level of key genes in tea

紫色茶葉中富含花青素等黃酮類(lèi)化合物，高濃度黃酮類(lèi)化合物的茶產(chǎn)品對(duì)于人體健康有益。近年來(lái)，很多研究者開(kāi)始探索富含花青素的茶葉品種[17-18]。茶葉的品質(zhì)受到茶樹(shù)顏色的影響，特殊顏色的茶樹(shù)由于其所含有的生化成分而受到廣泛關(guān)注。黃酮類(lèi)化合物被認(rèn)為是茶產(chǎn)品中最重要的品質(zhì)參數(shù)，他們決定了茶產(chǎn)品的顏色和味道。兒茶素是導(dǎo)致澀味和苦味的主要原因[19]，而花青素可以與兒茶素和茶黃素結(jié)合[20]。相比于綠色茶葉，紫色茶產(chǎn)品具有獨(dú)特的口感和甜味。

本研究通過(guò)比較紫色和綠色葉在轉(zhuǎn)錄水平的差異，分析紫色葉中與花青素和類(lèi)胡蘿卜素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)變化，揭示不同顏色茶葉形成的機(jī)制。已經(jīng)有很多研究報(bào)道了紫葉茶品種的葉片化學(xué)組成和顏色形成的分子機(jī)制。紫色葉的形成與色素的代謝密切相關(guān)，植物組織的顏色主要由葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素和黃酮化合物三種主要的色素決定[16]。黃酮類(lèi)化合物通常是導(dǎo)致葉片呈紅色、藍(lán)色和紫色的原因，當(dāng)黃酮的含量比較高，足以掩蓋葉綠素的顏色時(shí)葉片就會(huì)變?yōu)槠渌伾玔21]。在之前的研究中，發(fā)現(xiàn)紫色葉中的花青素和總黃酮含量比綠色葉高很多[5]。

我們通過(guò)通路富集找到了類(lèi)黃酮/花青素生物合成過(guò)程中的一些關(guān)鍵基因，這些基因在紫色葉中的表達(dá)水平顯著高于綠色葉，推測(cè)黃酮類(lèi)化合物很可能與茶樹(shù)紫色葉的形成有密切聯(lián)系。在紫色葉中花青素合成相關(guān)的基因CHS、CHI、F3H和F3'5'H等表達(dá)量顯著上調(diào)。這些基因的表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致黃酮類(lèi)/花青素生物合成途徑中的代謝物的積累，如矢車(chē)菊色素-3葡萄糖苷、飛燕草色素-3-葡萄糖苷和天竺葵色素-3-葡萄糖苷，會(huì)導(dǎo)致這些產(chǎn)物在紫色葉中保持較高水平。而代謝組研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類(lèi)/花青素生物合成途徑中的代謝物在紫葉中保持高水平，而卟啉、葉綠素代謝和類(lèi)胡蘿卜素生物合成的中間體在綠葉中表現(xiàn)出高水平[22]。這和我們轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)果一致，進(jìn)一步揭示了茶樹(shù)品種葉色變化的機(jī)制。

我們發(fā)現(xiàn)5個(gè)UGT75L6基因在紫色葉中表達(dá)下調(diào)，1個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。之前在梔子花中色素積累研究發(fā)現(xiàn)，UGT75L6的表達(dá)量與果實(shí)中色素積累并無(wú)顯著相關(guān)性[23]。UGT基因是糖基轉(zhuǎn)移酶家族，負(fù)責(zé)將糖部分連接到多種受體底物上，包括碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和次級(jí)代謝物[24-25]。UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶利用高度特異性的糖供體以及糖受體[26]，UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶是花青素和黃酮醇生物合成中的最終酶。在78個(gè)UGT家族基因當(dāng)中，UGT78G1和UGT78D2參與到了花色素、黃酮醇、黃酮及異黃酮的生物激活，并且參與花青素的糖基化[27-28]。而另一種UGT78A14的研究中，發(fā)現(xiàn)它參與了黃酮醇-3--O-葡萄糖苷的生物合成[29]。值得一提的是，一種新發(fā)現(xiàn)的UGT72AM1在紫色茶葉中有更高的表達(dá)量，而且在酶測(cè)定實(shí)驗(yàn)中證實(shí)UGT72AM1具有花青素 -3-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶的活性[30]。UGT75L6屬于次生代謝產(chǎn)物糖基轉(zhuǎn)移酶（PSPGs），有研究報(bào)道，UGT7516最有可能位于葉綠體中[23]。在紫色葉中，葉綠素含量下降，我們推測(cè)可能和UGT7516基因表達(dá)量下調(diào)存在關(guān)聯(lián)。我們的研究表明，UGT75L6在紫色葉中大都表現(xiàn)為表達(dá)下調(diào)。我們推測(cè)UGT75L6基因表達(dá)與花青素積累無(wú)明顯關(guān)聯(lián)，而且在紫色葉中，UGT75L6的表達(dá)受到抑制。這可能表明UGT75L6沒(méi)有花青素-3-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶活性。

黃酮類(lèi)化合物在植物抵抗寒冷、干旱和UV-B輻射等逆境中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)對(duì)植物的生長(zhǎng)起著調(diào)節(jié)作用[31]。茶葉中較高含量的黃酮類(lèi)化合物可以保護(hù)茶葉免受高光損傷和其他不利的環(huán)境壓力，使得紅芽直立茶具有良好的抗性，可以作為茶樹(shù)育種的重要資源。在之前的研究中已經(jīng)克隆了許多參與花青素代謝途徑的基因，并且已經(jīng)報(bào)道了這些基因的表達(dá)模式與積累的花色素苷之間的關(guān)系[5]。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定到了浙江紅花山茶花中與花青素代謝相關(guān)的9個(gè)基因，包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查爾酮合成酶（CHS）、黃烷酮3-羥化酶（F3H）和二氫黃酮醇還原酶（DFR）[32]。通過(guò)對(duì)CHS和F3H表達(dá)序列標(biāo)簽進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)了它們的表達(dá)水平在“紫鵑”茶的嫩葉中顯著高于老葉[33]。這些研究證實(shí)了黃酮生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵基因?qū)ㄇ嗨胤e累的重要性。

類(lèi)胡蘿卜素是植物中另一種重要的天然色素，在植物光合作用和對(duì)外界的響應(yīng)方面具有重要作用[34]。同時(shí)具有光保護(hù)和清除自由基的作用，是植物光合速率和營(yíng)養(yǎng)情況的重要指標(biāo)[35]。人們普遍認(rèn)為核心類(lèi)胡蘿卜素途徑在大多數(shù)植物物種中是保守的，然而不同的植物中類(lèi)胡蘿卜素的積累具有其特性。植物中類(lèi)胡蘿卜素代謝合成調(diào)控非常復(fù)雜，從茶葉轉(zhuǎn)錄組的角度來(lái)看，紫色葉中類(lèi)胡蘿卜素的積累是受限的。代謝組研究也表明，綠色茶葉中類(lèi)胡蘿卜素生物合成中的中間體含量較高，而在紫色茶葉中含量較低[30]。從轉(zhuǎn)錄組研究來(lái)看，類(lèi)胡蘿卜素生物合成中的關(guān)鍵基因 PDS、lcyB、ZEP和NCEN等都在綠色茶葉中表達(dá)更高。

之前研究顯示，類(lèi)胡蘿卜素可以作為在花青素/黃酮類(lèi)含量降低時(shí)的補(bǔ)充，綠葉中的類(lèi)胡蘿卜素有助于確保有效的光合作用，清除各種活性氧[36]，并保護(hù)葉綠素免受光氧化作用[37]。所以類(lèi)胡蘿卜素的升高也有助于保持葉綠素含量，這是造成葉片顯示綠色的原因之一。此外，植物中類(lèi)胡蘿卜素的合成受到多方面的影響，茶葉中類(lèi)胡蘿卜素的分解主要是通過(guò)9-順式-環(huán)氧類(lèi)胡蘿卜素雙加氧酶（NECD）來(lái)完成的，它是控制類(lèi)胡蘿卜素向脫落酸（ABA）轉(zhuǎn)化的限速酶[38]。ABA是重要的植物激素，可以抑制細(xì)胞分裂，促進(jìn)葉片的衰老和脫落。紫色葉和綠色葉相比，編碼NECD的5個(gè)同源基因的表達(dá)量有3個(gè)是降低的，并且紫黃質(zhì)的合成也受到抑制，說(shuō)明紫色葉中的ABA的合成不足，紫色葉具有更強(qiáng)的抗老化能力。