城步峒茶資源主要生化成分遺傳多樣性分析

寧 靜，劉 振，楊擁軍，楊 陽*，沈程文，張曙光*，肖敦旺，馬良元

（1.湖南省農業科學院 茶葉研究所，湖南 長沙 410125；2.湖南農業大學 園藝園林學院 茶學系，湖南長沙 410128；3.城步縣農業局，湖南 城步 422500；4.城步天仁大峒茶業有限公司，湖南 城步 422500）

茶樹[Camellia sinensis(L.) O.Kuntze]種質資源是茶樹種質創新、品種選育、生產利用的物質基礎，合理選用優良種質是提高育種成效的技術關鍵之一[1]。城步峒茶原產于湖南省城步縣境內，是湖南四大典型地方茶樹群體資源之一。陳興琰等[2]、陳國本[3]、石林[4]認為，城步峒茶是茶樹由原始喬木型向灌木栽培型馴化的重要見證，是湖南四大茶樹地方群體資源中與云南大葉種親緣關系最近的類型。張貽禮和胡萬選[5]、黎星輝等[6]研究認為，峒茶屬南方型大葉茶樹，適制紅碎茶，內質優異，風格獨特。袁春華等[7]對城步峒茶植株、樹型、樹姿、葉片和花器官等形態特征進行研究，認為城步峒茶產地可能是茶樹原產地的“尾聲”區域。因此，收集、保存、鑒定、評價和開發利用城步峒茶種質資源對于湖南茶產業的發展具有十分重要的意義。

茶樹鮮葉中的生化成分組成及含量決定了茶葉品質的優劣以及名優茶的適制性，從而決定了茶樹品種資源的利用價值和開發效益[8-10]。可見，對茶葉品質成分進行測定分析是研究茶樹品種資源特性、篩選優異茶樹資源和對資源進行開發利用的基礎。而目前對城步峒茶資源主要生化成分的多樣性分析尚未見研究報道。本試驗以17份有代表性的城步峒茶單株為研究對象，在同一生境下進行鑒定評價，分析研究其主要生化成分的遺傳多樣性，并從中發掘出一些特異資源，為深入研究與利用城步峒茶資源提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以城步縣境內城步峒茶群體種質資源為研究對象，經現場考察后根據形態差異收集17份有代表性單株（表1），其中青葉峒茶10份，黃葉峒茶7份。

1.2 測定方法

參照陳亮等[11]編寫的《茶樹種質資源描述規范和數據標準》的方法，在春季采摘第1 輪新梢的一芽二葉制作生化樣，用于生化成分測定。水浸出物含量測定參照GB/T 8305-2013；茶多酚含量測定參照GB/T 8313-2008；氨基酸總量測定參照GB/ T8314-2013；咖啡堿含量測定參照GB/T 8312-2013；兒茶素單體測定采用液相色譜法。

表1 17份城步峒茶資源的基本情況Table 1 Basic data of 17 Chenbu Dong Tea plant germplasms

1.3 統計分析

基本統計數據和生化成分多樣性指數分析采用Excel 進行，主成分分析和聚類分析通過 SPSS 21.0 統計軟件進行。主成分分析采用Factor 過程的 Varimax (方差最大化正交旋轉)，對各變量進行方差最大化正交旋轉，提取累計貢獻率大于85% 的主成分[12]。聚類分析采用離差平方和法（Ward′s method），平均歐氏距離。多樣性指數的計算采用 Shannon-Weave 信息指數[13]，即（H′）=-∑PilnPi，其中Pi為某性狀第i個代碼出現的頻率。計算遺傳多樣性指數（H′）前先對數量性狀進行質量化處理，對數值性狀進行10 級分類：1 級＜-2s，10 級≥+2 s，中間每級差 0.5 s，為平均數，s 為標準差。

2 結果與分析

2.1 主要生化成分表現和遺傳多樣性分析

由表2 可以看出，17份城步峒茶資源的生化成分平均遺傳多樣性指數（H'）為2.34，變化范圍為1.63%～2.78%，表現出豐富的生化多樣性。15個指標中，遺傳多樣性指數最大的是EC，達 2.78，說明EC 含量在城步峒茶種質中多樣性較廣泛，所包含的信息量較大；其次為咖啡堿和EGCG 含量，分別為2.72 和2.65；最小為水浸出物含量，僅為1.63。

變異系數是衡量各觀測值變異程度的一個統計量[14]。在影響茶葉品質的4 項常規生化成分（水浸出物、氨基酸、茶多酚、咖啡堿）中，變異系數最大的是咖啡堿，達20.04%；其次是氨基酸和酚氨比，分別為17.48%和17.18 %；最小的是水浸出物，僅為3.27%，說明這4個成分中，咖啡堿和氨基酸的改良潛力較大，而水浸出物的改良潛力最小。水浸出物含量最高的是HD1806（43.64%），最低的是QD1808（40.98%），平均為40.98%；82.35%的資源水浸出物含量超過40%，說明城步峒茶內含物質豐富。茶多酚含量最高的是QD1807（35.10%），最低的是QD1801（27.62%），平均為31.14%，茶多酚含量＞30%的單株11個，占資源的64.71%，其中＞35%的單株2個：QD1807（35.10%）和HD1802（35.05%），可篩選為高茶多酚資源。氨基酸含量最高的是QD1803（4.00%），最低的是QD1801（2.18%），平均為3.07%，47.06%的資源氨基酸含量低于3%。咖啡堿含量最高的是HD1804（5.74%），最低的是HD1807（2.39%），平均為4.14%，咖啡堿含量＞4.00%的單株有11個，占資源的64.71%，屬于較高咖啡堿茶樹資源，其中＞5.00%的單株有兩個：QD1810（5.11%）和HD1804（5.74%），為高咖啡堿茶樹資源。

酚氨比是一個體現茶樹資源適制性的生化指標，酚氨比小于8，一般適制綠茶，酚氨比在8～15 之間為紅綠茶兼制型，酚氨比大于15，一般適制紅茶[15]。城步峒茶資源酚氨比變幅為7.67%～13.43%，平均為10.28%，以HD1803 最高，QD1803 最低。其中只有1份資源的酚氨比小于8，其余資源的酚氨比均在8～15 之間，具有紅綠茶兼制特性，占資源的94.1%。

兒茶素是茶葉保健功能的主要成分，其含量和組成與茶葉品質密切相關，也是體現茶樹資源進化類型的一個重要指標[16]。由表2 可以看出，17份城步峒茶資源的兒茶素組分含量整體變異系數較大，資源變異類型較多，在育種上的選擇范圍大。非酯型兒茶素的變異系數高于酯型兒茶素，變異系數最大的是EGC 的含量，達到 52.23 %，其次是 EC 和 C，而且在體現茶樹進化程度的EC 和C 占整個兒茶素的比例上，城步峒茶資源也包含豐富的類型，高的達到10.54 %，低的僅為2.33 %，存在豐富的變異(CV=30.48 %)，說明城步峒茶資源在進化程度上存在豐富的多樣性，既具有比較原始的類型，也有進化程度較高的類型。17份資源中，兒茶素總量＞17%有1份（HD1802），酯型兒茶素＞12%的資源有2份（QD1807 和HD1806）。

表2 主要生化成分的基本統計參數和遺傳多樣性指數Table 2 Basic statistical parameters and genetic diversity index of main biochemical composition

2.2 生化成分的主成分分析

主成分分析能夠較好地解釋群體方差的主要來源，從而獲得解釋方差的重要性狀并簡化研究性狀，以利于更好地研究群體[17]。以 17份資源15個生化成分為變量，以累積貢獻率≥85%為標準，確定了 4個主成分（表3）。結果發現，前4個主成分的累計貢獻率達85.20%，這4個主成分包含了所有性狀的大部分信息，可以用來對材料進行綜合評價[18]。第1 主成分貢獻率達到29.76%，貢獻最大的是酯型兒茶素和EGCG，其次是茶多酚和兒茶素總量，反映的主要是酯型兒茶素含量的信息；第 2主成分貢獻率達到29.29%，貢獻最大的是非酯型兒茶素，其次是GC 和EGC，反映的主要是非酯型兒茶素含量的信息。第3 主成分貢獻率達到15.18%，貢獻最大的是負值的氨基酸含量，其次是酚氨比，反映的主要是酚氨比的信息；第4 主成分貢獻最大的是C，其次是GCG。

2.3 城步峒茶資源的聚類分析

根據15個生化成分數據，將17份城步峒茶資源進行聚類分析（圖1），同時根據聚類的結果比較分析了各類群生化成分的差異（表4）。

由圖1可知，當在遺傳距離為10 時，可以將17份城步峒茶資源聚為3個類群。其中有8份峒茶資源聚到第Ⅰ類群中，并分為2個亞群：QD1810、HD1804、QD1807、QD1803、QD1804 和QD1802為一個亞群；HD1802 和HD1806 為一個亞群。第Ⅱ類群包括5份峒茶資源：QD1805、HD1801、QD1808、QD1809 和HD1807。第Ⅲ類群包括4份峒茶資源：QD1801、HD1805、QD1806 和HD1803。

由表4可知，三個類群除了水浸出物含量不存在顯著差異外，其他各生化成分均有顯著的差異。第Ⅰ類群的水浸出物、茶多酚和氨基酸含量是三個類群中最高的，酚氨比10 左右，屬紅綠茶兼制型；第Ⅱ類群茶多酚含量較高，氨基酸含量較高，酚氨比9 左右，也是紅綠茶兼制的資源；第Ⅲ類群的茶多酚含量較高，氨基酸含量較低，酚氨比大于12，是適制紅茶的資源。從總體上看，三個類群的資源茶多酚含量（＞29%）都較高，氨基酸含量＜4%，酚氨比均大于8，說明城步峒茶大部分資源適制紅茶。

圖1 城步峒茶資源的聚類分析Fig.1 Dendrogram of 17 Chenbu Dong Tea germplasm resources

2.4 特異種質資源的篩選

在茶葉深加工中功能性成分的提取和高含量功能性成分茶產品的生產過程中，生化成分含量特異的茶樹種質往往是其生產的重要原料來源，同時該類種質可以作為雜交育種的親本用于今后育種的研究[19]。本研究根據生化成分測定結果，參照《農作物優異種質資源評價規范-茶樹》（NY/T 2031-2011）相關指標及有關文獻，從17份城步峒茶資源中初步篩選出21份生化成分特異的種質，還有一批潛在的優良資源，詳見表5。這些特異資源可以作為育種親本用于今后的育種研究或者直接利用。

表5 生化成分含量特異的資源Table 5 Some special germplasms on biochemical compositions

3 討論

通過對篩選的17份資源進行系統鑒定評價，發現城步峒茶資源的主要生化成分存在較高的遺傳多樣性，平均多樣性指數達到2.34。變異類型比較豐富，在很多成分上變異系數較高，有很大的選擇潛力。另一方面，從本研究結果可以看出，城步峒茶資源既有進化上比較原始的類型（EC 和C 的比例較高），也有進化程度較高的類型（酯型兒茶素比例高），這可能與城步苗族自治縣與廣西壯族自治區龍勝縣接壤，而桂西北地區屬于西南茶區，毗鄰茶樹的起源中心，在自然環境上與其相似，可能是茶樹的次生中心之一[20]，在茶樹資源的分布上，蘊藏著一些進化程度較低的類型，而其他地方的資源則在進化程度上較高，所以在生化成分的分布上表型比較豐富。

15個生化成分變量表現出連續性變異，變異幅度和變異系數均較大，平均變異系數達24.43 %，比相鄰近的廣西(25.80 %)[21]、四川(26.80 %)[22]偏低，而比云南(16.53 %)[23]偏高。在17份資源中，水浸出物、茶多酚、氨基酸和咖啡堿含量的平均值分別為 40.98%、31.14%、3.07%和 4.14%。與廣西、四川、云南茶樹資源茶多酚含量、咖啡堿含量相比偏高。本研究中，水浸出物含量最高達43.64%，最低為37.67%，有82.35 %的資源超過40%，說明城步峒茶內含物質豐富；茶多酚含量最高為35.10%，最低為27.62%，有64.71%的資源大于30%，屬于高茶多酚資源；氨基酸含量最高為4%，最低為2.18%，有47.06%的資源低于3%；咖啡堿含量最高為5.74%，最低為2.39%，有64.71%的資源大于4%，屬于高咖啡堿資源。楊亞軍[9]、陸錦時等[24]的研究結果認為，適制紅茶的品種氨基酸含量相對較低，茶多酚、兒茶素、水浸出物和咖啡堿含量較高，酚氨比高。根據這個標準，城步峒茶大部分資源適制紅茶。

表4 不同類群的主要生化成分比較Table 4 Comparision of main biochemical components of different groups

根據 17份資源 15個生化成分變量分析，前4個主成分累計貢獻率達85.197%，保留了15個生化成分的信息。其生化因子對品質的貢獻依次為：酯型兒茶素構成因子＞非酯型兒茶素構成因子＞酚氨比構成因子。第 1 主成分中貢獻率最大的為酯型兒茶素（0.912）和EGCG（0.889），表明在所分析的15個生化成分中酯型兒茶素和EGCG 對茶葉品質的影響較大。從各主成分對品質育種有價值的入選材料應是第1主成分因子適中偏大，第 2、第3 主成分適中，第4 主成分適中偏小。

聚類分析將17份資源劃分為三大類群，每個類群的生化成分存在較大差異，決定了適制性不同。酚氨比是判定茶樹資源適制性的一個指標，一般認為酚氨比小于8 適制綠茶，大于15 適制紅茶。而新標準GB/T 8313-2008 測得，茶葉茶多酚含量比 GB/T 8313-2002 標準降低了30%～40%[25-27]；本研究認為，采用 2008 相關標準檢測茶多酚和氨基酸以楊亞軍等[28]認為酚氨比小于7 適制綠茶，大于10 適制紅茶較為實際。因此，在此次17份資源中，按照此數值進行比較，適制綠茶資源只有1份，紅綠茶兼制型資源7份，適制紅茶資源9份。依據這些標準，第Ⅰ、Ⅱ類群為紅綠茶兼制型，第Ⅲ類群則為適制紅茶型。分類結果與實際結果大致相符。

通過系統的鑒定評價，初步篩選出一批生化成分優異的資源。17份資源的茶多酚含量均≥25%，屬高茶多酚特異資源；選出咖啡堿含量大于4%的潛在優異資源11份，其中QD1810和HD1804 為咖啡堿≥5%的特異資源；選出兒茶素含量大于17%的資源1份：HD1802，酯型兒茶素大于12%的資源2份：QD1807 和HD1806。這些資源在某一成分或幾個成分上（如QD1807、HD1802 和QD1810 等）具有較高的含量，對這些優異資源進行深入研究，可以在深加工上直接利用或為今后茶樹雜交育種提供新的親本材料。