基于火焰原子發射光譜法血清鈉離子候選參考方法的建立

劉春龍，胡 月，薛利寧，任軼昆，孫 茜

(生化診斷試劑檢驗技術北京市重點實驗室，北京 100176)

鈉離子是細胞外液如血液中最多的陽離子，對保持細胞外液容量、調節酸堿平衡、維持正常滲透壓和細胞生理功能具有重要意義，并參與維持神經-肌肉的正常應激性。細胞外液鈉濃度的改變可由水、鈉任一含量的變化而引起，所以鈉平衡紊亂常伴有水平衡紊亂。水與鈉的正常代謝及平衡是維持人體內環境穩定的重要因素。因此，血清鈉的測定具有重要的臨床意義，尤其有助于電解質紊亂的治療。然而，由于臨床常規檢驗血清鈉離子的方法學較多，且不同方法學之間存在一定的差異，導致其測量結果的標準化工作困難重重。近年以臨床檢驗標準化為目的的量值溯源受到重視[1]。建立穩定有效的參考方法對于促進鈉離子檢驗標準化具有重要價值是行業內共識。臨床檢驗參考方法的主要作用是建立和評價常規方法的準確性[2]。本研究基于火焰原子發射光譜法，嘗試建立一種穩定性好，準確度高(正確度和精密度良好)的血清鈉離子候選參考方法，為體外診斷廠家鈉離子常規測量系統向參考系統溯源提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1原料 氯化鈉GBW(E)060024C國家標準物質(純度99.97%)、濃硝酸(濃度15.4 mol/L)、氯化鉀(鈉含量≤0.02%)，均購自Sigma公司。

1.1.2儀器 島津AA-7000原子吸收分光光度計、哈密爾頓Microlab-500型稀釋配液儀、賽多利斯CP225D型電子天平、Eppendorf移液器。

1.2試劑配制

1.2.1總原則 所有與試劑、水或樣本接觸的玻璃或者塑料器皿均按下面的序列清洗：放在0.77 mol/L HNO3中浸泡60 min,然后用去離子水沖洗(至少6次)，最后在無塵環境中倒置自然干燥。

1.2.2配制步驟 (1)氯化鉀(KCl)稀釋液(KCl 4.5 mmol/L)：稱取0.336 g KCl，在轉移到1 000 mL容量瓶中，用去離子水定容，顛倒20次混勻。氯化鉀溶液作為鈉標準貯備液的稀釋液和空白貯備液使用。保存條件：2～8 ℃。(2)鈉標準貯備液：準確稱取0.642 8、0.701 3、0.759 7、0.818 2、0.876 6和0.935 0 g干燥的編號為GBW(E)060024C的國家標準物質，分別轉移至100 mL容量瓶中，用氯化鉀稀釋液(4.5 mmol/L)定容，顛倒20次混勻。保存條件：2～8 ℃。(3)全部溶液都放至室溫，用稀釋配液儀按1∶100用水稀釋鈉標準貯備液和樣本。

1.3測量參數 島津AA-7000原子吸收分光光度計參數設置為波長589.5 nm、光譜帶寬0.2 nm、氣體類型Air-C2H2、燃氣流量1.8 L/min、燃燒頭高度7 mm。

1.4測量步驟 調零后測量從160 mmol/L的標準貯備液稀釋的標準液發射光相對強度，發射光相對強度值的重復性在±0.5%以內，儀器達到穩定狀態。分別測量空白和標準液，并記錄它們的發射光相對強度值E(儀器自動扣除空白)。用扣除空白后的發射光的相對強度值做標準曲線，回歸系數r2應大于0.999 0。用國際標準物質909C評估方法的正確度，重復測量3次。用利德曼公司兩濃度工作校準品評估方法的精密度，每天重復測量5次，連續3 d。

1.5統計學處理 以濃度值為X軸，扣除空白后的發射光的相對強度值為Y軸，使用Excel2007軟件繪制線性回歸圖，即標準曲線。國際參考實驗室能力驗證計劃(Rela)中鈉離子的合格標準為小于1.25%，計算國際標準物質909C實測值與靶值的相對偏移，為保證所建立參考方法滿足Rela的要求，本研究制定相對偏移合格標準為小于1.00%；計算利德曼公司兩濃度工作校準品實測值的總不精密度，依據利德曼公司企業標準，合格標準為小于1.50%。

2 結 果

2.1方法的線性 對該候選參考方法進行優化后，標準曲線實驗結果見圖1，線性方程為Y=0.001 240 7X+0.006 685 7，r2=0.999 2>0.999 0。

圖1 鈉離子標準曲線

2.2方法的正確度 國際標準物質909C靶值為141.84 mmol/L，實測值與靶值偏移均小于1.0%，正確度驗證通過，實測數據見表1。

2.3方法的精密度 利德曼公司高低兩濃度工作校準品的總不精密度分別為0.57%和1.23%,兩者均小于1.50%，精密度驗證通過，實測數據見圖2，圖中不同形狀的點分別代表3 d的精密度驗證結果分布情況。

表1 鈉離子正確度

圖2 鈉離子精密度散點圖

2.4Rela Rela結果在等效限范圍內，進一步可證明所建方法的正確度和可靠性。回報結果見圖3，箭頭所標示點為本實驗室結果，其他方框代表各測量結果的不確定度。

圖3 Rela鈉離子回報結果

3 討 論

準確的臨床檢驗結果，具有跨時空的可比性，是防病治病和提高人類健康水平的基本需要，也是檢驗醫學界的工作目標[3]。其中血清鈉離子的檢測由于實驗室常規方法有離子選擇性電極法、原子吸收分光光度法、火焰光度法、比色法和酶法等，不同的方法學之間存在一定的差異。血清鈉離子又是臨床醫生判斷電解質紊亂情況的重要指標，量值溯源被認為是實現臨床檢驗標準化唯一而有效的途徑，而參考系統(包括參考物質、參考測量程序、參考實驗室)，尤其是參考測量程序在實現量值溯源過程中起到承上啟下的作用[4-5]。因此各體外診斷廠家有必要按臨床化學和檢驗醫學聯合會(IFCC)的標準，建立血清鈉離子的參考方法。也可通過方法學比對的方法，將常規方法與之比較，以體現常規方法的正確度[6]。

火焰原子吸收光譜法被廣泛應用于金屬元素的測定，測定簡便，結果可靠[7]。本研究建立的鈉離子候選參考方法基于火焰原子發射光譜法，將血清用去離子水采用稱重法準確稀釋，進行分析與測定。發射光譜法是測定被測定離子的發射光相對強度。樣品中的鈉原子接受火焰的熱能而被激發處于激發態。激發的原子不穩定，立即發射出特定波長的光線，迅速回到基態。發射光線的強度與樣品中的鈉離子的濃度呈正比關系[8]。該研究的創新點在于通過優化火焰原子吸收光譜法的參數和流程建立了鈉離子參考方法，可作為鈉離子檢測的“金標準”，為鈉離子的量值溯源工作提供了基礎。需要說明的是，該參考方法運行成本較高，通量較小，不適用于臨床實驗室的常規測量，建議在規范的醫學參考實驗室運行。該方法良好的精密度是實現標準化的重要前提和基礎。如果不解決實驗室內測量精密度問題，測量標準化則無從談起[9]。

參考方法的建立務必建立在對各個細節的嚴格確認的基礎上。按照參考實驗室的標準進行試劑配制，控制“人、機、料、法、環”[10-11]。本研究中儀器設備的狀態非常重要，如島津AA-7000使用前主機需預熱60 min以上，空心陰極燈需預熱30 min以上。確認火焰狀態，調整分壓閥空氣壓力為0.35～0.38 MPa，乙炔氣瓶需調整壓力為0.09～0.10 MPa。檢查燃燒器，確認預混合室和霧化器中潔凈無異物。吸入超純水后預熱機器10 min。文中所述制備溶液的物質均指100%含量，若不足，應按照純度進行換算。選用稀釋配液儀對鈉標準貯備液和樣本進行稀釋，可明顯提高測量的重復性水平。對于鈉濃度較高的樣品，會因稀釋倍數過大，降低測定的精密度，因此常選用次靈敏線測定[12]。

從理論上來講，各個醫院檢驗科每日常規工作的結果，均應溯源至參考系統的結果[13]。本文所建立的候選參考方法，仍需進一步研究和完善，補充該方法的抗干擾、穩健性等[14]。該法的建立可促進血清鈉離子的標準化進程，為體外診斷廠家常規試劑盒的量值溯源提供了新的途徑[15]。同時，運行該參考方法的實驗室必須滿足ISO17025和ISO15195的基本要求[16-17]。

本研究成功建立了基于火焰原子發射光譜法的血清鈉離子候選參考方法，可極大地推進血清鈉離子的標準化進程，為血清鈉離子試劑盒的量值溯源提供了保障。