IM患兒外周血單核細胞TLR2、TLR9及CD19+、CD23+表達水平及意義

孫 丹,李艷艷,田秀穎,錢 同

(徐州市兒童醫院檢驗科,江蘇徐州 221000)

傳染性單核細胞增多癥(IM)是發生在EBV感染之后常見的表現形式，作為兒童時期常見的感染性疾病之一，近年來發病率逐漸在增加[1]。有研究指出B細胞是EBV感染的最初靶細胞，在淋巴細胞中CD19+為B細胞，而CD19+和CD23+同時為陽性即為永生B細胞，在EBV侵入機體后，Toll樣受體(TLRS)參與了該病毒病原體的識別，同時在EBV的感染及轉歸中起到了重要的作用，TLR2和TLR9是該受體的重要組成成分[2]。本研究將通過觀察IM患者外周血某些指標在不同時期內的變化并對其在IM發病過程中的作用進行探究。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2018年1月本院兒科初治的IM患兒40例作為研究對象，40例IM患兒根據IM治療過程分期分為急性期組(初始發病至1周時間內)和恢復期組(初始發病期進行治療后第25～30天)[3]，年齡2～13歲，平均(6.93±3.72)歲，其中男21例，女19例；納入標準：符合IM診斷的標準且均為初次發病且均無糖皮質激素類藥物或細胞毒性藥物使用史。另選取同期在本院兒童保健門診進行常規體檢的40例健康兒童作為對照組，年齡2～12歲，平均(7.09±4.11)歲，其中男22例，女18例；對照組均無發生變態反應性疾病史和其他免疫性的疾病，各組在性別和年齡上比較差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。參與本次研究的患兒均簽署了知情同意書，且本研究均經過了本院倫理學會討論通過。

1.2樣本采集處理 分別采集各組靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，樣本采集當天后進行B細胞流式細胞分析，分離的血漿進行TLR2和TLR9熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)分析。

1.3指標測定 采用CD19+和CD19+CD23+由美國BD公司提供的BD FACSCantoTM流式細胞儀器進行測定。相應的配套試劑也由該公司提供。TLR2和TLR9的mRNA測定采用美國 ABI 公司7900 hT Fast Real-Time PCR System 型實時熒光定量 PCR儀器進行測定；其中引物由上海生物工程技術公司提供。Trizol 試劑盒購自美國 Invitrogen 公司，逆轉錄試劑盒購自美國 ABI公司，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購于大連寶生物工程有限公司；根據參考基因進行相對定量的ΔCt法計算目的基因相對表達量的計算。

2 結 果

2.1各組CD19+和CD19+CD23+表達情況 通過研究發現，急性期組的CD19+和CD19+CD23+陽性表達率顯著低于恢復期組和對照組，差異有統計學意義(P<0.05);恢復期組的CD19+和CD19+CD23+陽性表達率顯著低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組CD19+和CD19+CD23+陽性表達率(%，±s)

注：與急性期組比較，#P<0.05；與恢復期組比較，*P<0.05

2.2各組TLR2mRNA和TLR9mRNA表達水平情況 急性期組TLR2mRNA和TLR9mRNA表達水平顯著高于恢復期組和對照組，差異有統計學意義(P<0.05);恢復期組的TLR2mRNA和TLR9mRNA表達水平顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組TLR2mRNA和TLR9mRNA表達水平±s)

注：與急性期組比較，#P<0.05；與恢復期組比較，*P<0.05

3 討 論

IM是由EBV感染所致。有研究指出淋巴B細胞的表面存在EBV的特異性受體，所以淋巴B細胞也成了該病毒持續感染的終身潛伏場所。在EBV細胞感染B細胞后可以逃避免疫的監視過程，為建立持續性感染的B細胞庫提供了機會，在細胞免疫功能低下的時候，造成了永生B細胞不斷地繁殖[4-5]。CD19+分子是B細胞表面的糖基化的跨膜蛋白，是B細胞表面的特異性蛋白，該蛋白水平直接代表了B細胞的水平。CD23+是主要在活化的B細胞表面表達的跨膜蛋白，可以作為B細胞活化的重要標志物，當CD19+分子和CD23+同時陽性時代表永生B細胞[6-7]。對于CD19+和CD23+兩個分子水平的測定，是對IM患兒外周血B細胞和永生B細胞水平的較好的反應[8]。在B細胞活化的過程中與B細胞表面的抗體是密不可分的，其中Toll樣受體提供了B細胞活化的途徑。最主要的兩種是TLR2和TLR9。TLR2能夠較多地識別配體，在EBV感染時是參與到免疫應答的直接受體，能夠直接地刺激B細胞激活，在EBV感染的時候能夠刺激炎癥因子的產生繼發相應的病理反應[9-10]。 TLR9能夠被EBV病毒的DNA基序所激活，能夠促進B細胞的激活，促進其增殖和活化，活化后的TLR9又能反過來上調TLR9。在動物實驗中已經有證實，在抗病毒的免疫應答中TLR9具有積極的作用[11]。

在本研究中發現，在急性期組的CD19+和CD19+CD23+的陽性表達率明顯低于恢復期，在感染的急性期，病毒入侵B細胞，在細胞表面的受體就會對抗原進行識別和提呈給免疫細胞，引起體內的免疫反應，進而對感染了EBV病毒的B細胞進行殺滅[11]。所以體內CD19+和CD19+CD23+陽性表達率就會下降，相對而言，急性期的下降幅度和數量要顯著高于恢復期的患兒。而處于恢復期的患兒上述指標表達水平也要低于對照組。同時本研究還發現，急性期組的TLR2mRNA和 TLR9mRNA水平要顯著高于對照組，且急性期組的二者要顯著高于恢復期組，Toll樣受體作為一種跨膜的信號傳遞受體，在識別入侵性的病原微生物中發揮著重要的作用[12-13]。在 IM 的急性期，TLR2 通過機體的固有免疫反應，限制 EB 病毒的傳播和表達，TLR9 識別 EBV且限制其傳播并控制已被病毒感染的潛伏 B 細胞而發揮作用[14]。在病原體侵入機體后，機體通過上調TLR2mRNA和 TLR9mRNA來更全面地識別和更迅速地提呈給免疫細胞，進行機體免疫反應[15]。在疾病處于恢復期時，TLR2與TLR9的配體對TLR2與TLR9的刺激作用減少，從而二者的mRNA表達下調。

4 結 論

IM患兒的外周血單核細胞TLR2、TLR9及CD19+、CD23+各分子指標在IM的患者的不同時期表達水平不同，這些指標可能參與了IM的發生和轉歸的全過程。