體外培養法與RNA等溫擴增法對脲原體檢測能力比較

劉亞麗,葉 莎,張文娟，王 潔，劉 暢，陳 雨,甘 勇,李 軍,竇亞玲△,徐英春

(1.中國醫學科學院北京協和醫院檢驗科,北京100730；2.巴州人民醫院檢驗科,新疆庫爾勒 841000；3.保定市傳染病醫院檢驗科,河北保定071000； 4.河北省人民醫院檢驗科,河北石家莊 050000；5.中國醫學科學院北京協和醫院皮膚科,北京100730 )

脲原體為黏膜相關病原體，主要存在于人體呼吸道及泌尿生殖道黏膜。當機體免疫力低下或接受侵襲性操作時，脲原體可進入血液引起感染甚至播散至其他器官。脲原體可通過直接接觸進行傳播，尤其在青春期性活躍健康人群下生殖道中可被分離到。從目前數據來看，脲原體可引起男性非衣原體、非淋球菌性尿道炎、急性附睪-睪丸炎、感染性結石，輸卵管型不孕癥、子宮內膜炎，還可引起極低體質量兒的下呼吸道感染、先天性肺炎、菌血癥等[1-6]。此外，近期的研究數據還顯示，由于脲原體會降低精液中精子濃度和影響精子活力而導致男性不育[7-10]。目前，針對脲原體的檢測方法有多種，包括顯微鏡檢查、抗原檢測、血清學試驗、體外培養法、分子生物學檢測等。其中，體外培養法和分子生物學檢測在臨床微生物實驗室中開展較多，且對臨床指導價值較大。通過體外培養的方法，24～48 h就可檢出脲原體，且可進行半定量和體外藥敏。一般認為，當男性尿道脲原體數量>104CFU/mL時，具有臨床意義[11-13]。分子生物學方法在對脲原體進行快速檢測的同時，部分方法還可將微小脲原體和解脲脲原體進行很好區分[14]。雖然，兩種檢測方法在國內多家實驗室均有開展，但目前還沒有關于二者橫向對比的研究。本研究將培養聯合測序法作為參考方法，橫向評估體外培養法和RNA恒溫擴增法對脲原體的檢測能力，從而為臨床診斷和治療提供更有利的指導?，F將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1-8月就診于北京協和醫院皮膚性病科、婦產科、泌尿外科等多個臨床科室，且送檢標本為首次尿的患者，共計103例。

1.2方法

1.2.1采集標本 無論男女患者，僅留取清晨首次尿，或長時間(至少2 h)不排尿后的前段尿0.5 mL。

1.2.2檢測方法 送檢后將標本平均分成3份，第1份采用RNA等溫擴增法檢測脲原體，第2份采用體外培養法進行檢測，第3份采用體外培養聯合測序法進行檢測，即培養結束后無論陽性陰性均要提取肉湯中核酸，進行普通PCR擴增和Sanger法測序。第3份測序的目的:(1)區分微小脲原體和解脲脲原體;(2)排除細菌污染可能。

1.2.3觀察指標 將體外培養聯合測序法作為參考方法，RNA恒溫擴增法和單純體外培養法作為待評估方法，分別評估兩種待評估方法對脲原體檢出的靈敏度和特異度。

1.2.4體外培養 采用法國生物梅里埃Mycoplasma IST 2試劑盒進行脲原體的檢測，具體操作步驟嚴格按照廠家說明書完成。藥敏折點：四環素S≤4.00 μg/mL R≥8.00 μg/mL；多西環素S≤4.00 μg/mL R≥8.00 μg/mL；克拉霉素S≤1.00 μg/mL R≥4.00 μg/mL；阿奇霉素S≤0.12 μg/mL R≥4.00 μg/mL；紅霉素S≤1.00 μg/mL R≥4.00 μg/mL；交沙霉素S≤2.00 μg/mL R≥8.00 μg/mL；環丙沙星S≤1.00 μg/mL R≥2.00 μg/mL；氧氟沙星S≤1.00 μg/mL R≥4.00 μg/mL；原始霉素S≤2.00 μg/mL。其中S代表敏感，R代表耐藥。

1.2.5RNA等溫擴增法 脲原體核酸檢測采用RNA等溫擴增法(上海仁度生物科技有限公司)，以16S rRNA作為靶基因。原理：帶有T7啟動子的引物與靶標RNA結合，開始逆轉錄合成cDNA；在莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶 (M-MLV RT)RNase H活性作用下，靶標RNA鏈降解，形成單鏈cDNA；之后反向引物與cDNA結合，在M-MLV RT聚合酶活性作用下，產生靶標核酸(RNA)的一個雙鏈DNA拷貝，且該雙鏈帶有T7啟動子。在T7 RNA聚合酶作用下，一條DNA雙鏈上產生多個(100～1 000個)RNA拷貝；每一個RNA拷貝再從反轉錄開始進入下一個擴增循環。采用Roche Light Cycler 480 (美國)主機擴增及Roche Light Cycler 480 Software release 1.5.0 SP4進行數據分析。

1.2.6普通PCR擴增與Sanger測序 從體外培養陽性和陰性的肉湯中提取核酸(德國QIAamp MinElute Virus Spin Kit_DNA提取試劑盒)，針對其脲酶基因進行普通PCR 擴增。針對脲原體采用通用引物-脲酶基因(GenBank 登錄號 AF085724和 AF085732),前引物：5′-CGA AAT TGT GAT GAA CGA AGG-3′；后引物：5′-GGT GAT AGC GTT AGA TTA GGA G-3′,418 bp[15]。PCR反應體系為30 μL,采用高保真PCR SuperMix Ⅰ (北京天根生物科技有限公司),反應條件為94 ℃ 4 min,94 ℃ 1 min,54 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,35個循環，72 ℃ 10 min。擴增產物采用Sanger測序法測定其序列，引物與PCR擴增引物相同。測序結果分別與GenBank AF085724和AF085732進行比對，僅當序列比對一致率在>99% 時才被認為準確鑒定到種。

1.3統計學處理 采用SPSS24.0進行統計學分析，3種不同方法對脲原體進行檢測，其檢出率行Pearson′sχ2檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1患者信息 該研究共收集了103份非重復尿標本，分別來自103例患者，其中男性80例(77.7%)，女性23例(22.3%)，男女構成比差異有統計學意義(P<0.05)。103例患者中，30～<40歲49例(47.57%)，患者人數最多；其余年齡段患者人數依次為20～<30歲28例(27.18%)、40～<50歲12例(11.65%)、0～<20歲6例(5.83%)、50～<60歲5例(4.85%)、≥60歲3例(2.91%)。

2.2不同檢測方法測定脲原體結果比較 基于體外培養聯合測序的方法，共有24例標本 (23.30%) 檢測出了脲原體，其中14例 (17.50%) 分離自男性，10例(43.47%) 分離自女性，差異有統計學意義(P=0.022)。從年齡段來看，40～<50歲脲原體檢出率最高[41.67%(5/12)]；其余年齡段檢出率依次是20～<30歲39.29%(11/28)；30～<40歲16.33%(8/49)；0～<20歲0%(0/6)、50～<60歲0%(0/5)和≥60歲0%(0/3)。如將體外培養聯合測序法作為參考方法，橫向評估體外培養法和RNA等溫擴增法的靈敏度和特異度，其結果為體外培養法靈敏度和特異度分別為75.00%(18/24)和100.00%(79/79)；RNA等溫擴增法的靈敏度和特異度分別為95.83%(23/24)和96.20%(76/79),差異無統計學意義(P>0.05),見表1。在體外培養法與RNA等溫擴增法結果不一致的8例標本中，全部屬于RNA等溫擴增法陽性，體外培養法弱陽性或陰性，經培養聯合測序驗證后，有5例(62.5%)證實存在脲原體。

2.3菌種鑒定 利用PCR聯合測序的方法，對24份脲原體檢出陽性標本進行了菌種鑒定。其中17例(70.83%)為微小脲原體，7例(29.17%)為解脲脲原體，未檢查到二者共同存在的情況。

2.4體外藥敏 18例培養陽性的標本進行了體外藥敏測定，其中多西環素、交沙霉素、四環素、原始霉素敏感率100.00%，克拉霉素、紅霉素和阿奇霉素的敏感率>80.00%，環丙沙星和氧氟沙星的體外敏感率分別為11.11%和22.22%，見表2。

表1 不同檢測方法測定脲原體結果比較

注：*表示脲原體數量小于104CFU/mL為陰性

表2 18例培養陽性脲原體體外藥敏試驗結果分析(%)

3 討 論

為避免標本對結果的影響，該研究僅采集清晨尿標本，混勻后平均分成3份，分別用3種不同的方法進行檢測。此外，為更好地評估體外培養法和RNA等溫擴增法的檢測性能，該研究采用體外培養聯合測序的方法作為參考方法。因為僅通過顏色判斷培養陽性或陰性是不夠準確的，所以該研究從培養液中提取核酸聯合PCR擴增和測序的方法驗證脲原體的真實性。

當橫向評估體外培養法和RNA等溫擴增法時，雖然二者靈敏度和特異度差異無統計學意義(P>0.05)，但從方法原理來講，RNA等溫擴增法的靈敏度相對較高，體外培養法的特異度稍高。體外培養法有6例培養陰性但參考方法陽性,部分由于培養法通過定量檢測可以排除定植，而核酸檢測則不能以此區分定植和感染。 在分析RNA等溫擴增法時，發現有1例屬于參考方法陽性、體外培養法培養液紅色而RNA等溫擴增法陰性的標本。研究者推測標本中可能存在干擾PCR反應的物質，但具體原因仍不清楚。另外，還有3例屬于RNA等溫擴增法陽性而參考方法陰性的情況。這3例均為男性患者，由于門診患者信息資料不全，且相關檢查不夠完善，已無法查證患者是否有典型的感染癥狀，抑或是無癥狀攜帶。

此外，該研究還對脲原體的菌種進行了進一步的鑒定。目前，脲原體分為解脲脲原體和微小脲原體兩種，其中以微小脲原體較常見[12]，與本研究結果完全相符。有研究表明，解脲脲原體和微小脲原體可同時存在[6,12]，但該研究未發現此種情況。另外，體外藥敏結果顯示，喹諾酮類藥物的耐藥率非常高。目前研究證明，GyrA、GyrB、ParC、ParE序列的改變是導致脲原體對喹諾酮類藥物耐藥的主要原因，尤其是ParC的 S83L突變最為常見[16-19]。由于機制研究不是本課題的研究重點，所以會在后續研究中進行深入探討。

4 結 論

與體外培養聯合測序法相比，體外培養法和RNA等溫擴增法均表現出了較好的靈敏度和特異度。但從臨床應用角度來講，二者聯合使用可能會對脲原體感染的診斷和治療提供更全面的指導。