miR-18a表達在HPV感染及宮頸癌發生發展中的意義

危 敏，余海浪，王涵多，雷 潔，韓璐好

(1.深圳市南山區婦幼保健院檢驗科遺傳室，廣東 深圳 518054；2.南方醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，廣東 廣州 510515)

宮頸癌是女性高發的惡性腫瘤，其發生一般需經歷從正常宮頸上皮到不同級別癌前病變的過程，平均需要5～20年。高危型人乳頭狀瘤病毒(HR-HPV)持續感染是宮頸癌的主要危險因素，90%以上的宮頸癌伴有HR-HPV感染[1]。

microRNA(miRNAs)是一類長度為19～25個核苷酸的內源性非編碼RNA，在轉錄后水平(RNA切割或翻譯抑制)負性調控靶基因的表達[2]。越來越多的研究顯示miRNAs在腫瘤的發生、侵襲、轉移和復發等過程中扮演著重要角色，并與其預后密切相關。人類血清或血漿中存在一些穩定性良好的循環miRNAs，并且正常人和不同類型腫瘤患者體內循環miRNAs的表達譜存在顯著差異[3-4]。此外，HPV感染陽性婦女的宮頸脫落細胞中miRNAs檢測對腫瘤早期診斷、分期和預后評估等方面也可能具有重要的作用[5]。因此，患者血清中及宮頸脫落細胞中異常表達的miRNAs可作為宮頸癌無創診斷和預后判斷的生物標志物，從而早期診斷宮頸癌，減少腫瘤的轉移和復發，為宮頸癌的診療提供突破點。

miR-18a可能作為癌基因在腫瘤發生中發揮重要的調控機制，其表達水平在乳腺癌、結直腸癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、肝癌、鼻咽癌、神經膠質瘤等腫瘤中顯著增高[6-7]，尤其在患者血清中可以檢測到高水平的miR-18a，提示該分子有希望作為一種新型腫瘤標志物用于腫瘤的無創性早期診斷，但其與宮頸癌的相關關系，目前未見文獻報道。

我們在前期研究中通過臨床組織標本檢測發現miR-18a表達水平在宮頸癌組織中明顯高于癌旁正常組織，基于此基礎，本實驗通過檢測宮頸脫落細胞中miR-18a表達與HPV感染之間的關系，以及HR-HPV感染的宮頸上皮內瘤變(CIN)及宮頸癌病變不同階段miR-18a表達，初步探討miR-18a表達在HPV感染及宮頸癌發生發展中的意義。

1資料與方法

1.1標本來源

收集2015年6月至2017年6月深圳市南山區婦幼保健院及廣州南方醫院門診及住院患者宮頸脫落細胞標本，將細胞刷放入Preserv Cyt細胞保存液中和用于HPV DNA檢測的保存液中保存，置于4℃冰箱。通過HPV分型檢測將宮頸脫落細胞分為HPV未感染組(NE-HPV)、低危型HPV感染組(LR-HPV)、高危型HPV感染組(HR-HPV)。

選取HR-HPV檢驗陽性標本，經病理學證實為宮頸癌(30例)和CIN(30例)，對照組選取年齡、體重配對的30例經液基細胞學檢查證實為宮頸上皮細胞正常無化生的女性，留取宮頸脫落細胞標本凍存。所有受試者均對本研究知情同意，本研究通過醫院倫理委員會批準進行。

1.2實驗方法

1.2.1 HPV DNA基因型檢測

取宮頸脫落細胞樣本保存液500μL，14 000r/min離心1min后棄上清，嚴格按照試劑盒(深圳亞能公司)操作說明進行提取。采用核酸分子快速雜交儀及配套試劑盒，應用標記有23種HPV基因型別寡核苷酸探針的低密度基因芯片雜交膜(18種高危型別：16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83；5種低危型別：6、11、42、43、44)，按照試劑盒說明進行雜交，酶標顯色。結果判斷：陽性結果可出現清晰的藍紫色斑點，根據不同型別HPV探針在膜上的具體位置，即可判斷感染HPV類型。

1.2.2總RNA提取和反轉錄反應

取宮頸脫落細胞樣本保存液500μL，采用miRCURYTM RNA提取試劑盒(日本Takara公司)提取總RNA，Nano-drop 2000分光光度計(美國Thermo公司)檢測總RNA的純度與濃度。反轉錄反應采用Mir-XTMmiRNA First Strand Kit試劑盒(日本Takara公司)將提取的總RNA反轉錄成cDNA，具體操作參照試劑盒使用說明。

1.2.3實時熒光定量PCR法檢測miR-18a表達

采用實時熒光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction， rt-qPCR)檢測宮頸脫落細胞標本中miR-18a表達水平。qPCR反應試劑盒SYBR Premix EX TaqTMⅡ購自日本Takara公司，具體步驟參照試劑盒說明書，以U6 snRNA為內參照，所有反應均在ABI 7500定量PCR分析儀(美國ABI公司)上進行。反應條件為：50℃激活聚合酶2min，95℃預變性1min；95℃變性5s，60℃退火/延伸1min，擴增40個循環，結束后通過95℃ 15s，60℃ 1min，85℃ 15s，60℃ 15s制作溶解曲線。每個樣本設3個復孔，計算3個復孔的平均Ct值為最終Ct值，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對含量。引物由上海Invitrogen公司合成。U6 snRNA上游引物為5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。miR-18a上游引物為5′-TAAGGTGCATC￣TAGTGCA￣GATAG-3′；下游通用引物由反轉錄試劑盒Mir-XTMmiRNA First Strand Kit提供(日本Takara公司)。

1.3統計學方法

采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計學分析，所得數據以均數±標準差表示，各組間比較采用獨立樣本t檢驗，ROC曲線評估組織miR-18a作為宮頸癌/CIN標志物的診斷價值。采用雙側檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1宮頸脫落細胞HPV DNA基因型檢測

如圖1所示，陽性結果可出現清晰的藍紫色斑點，病例3顯示為高危型HPV68型感染；病例6顯示為HPV11、16、42、52、59型混合感染；病例10顯示為高危型HPV51型感染。

圖1宮頸脫落細胞HPV DNA基因型檢測

Fig.1 Detection of HPV DNA genotype in cervical exfoliated cells

2.2宮頸脫落細胞中miR-18a表達情況

以ΔCT表示目的基因的表達水平，即ΔCT=目的基因CT值-內參基因CT值。圖2顯示NE-HPV組、LR-HPV感染組、HR-HPV感染組的宮頸脫落細胞中miR-18a表達水平分別為1.29±0.15、1.72±0.47、3.48±0.71，HR-HPV感染組miR-18a表達顯著高于LR-HPV感染組和NE-HPV組(t值分別為11.144、18.482，均P<0.05)，而LR-HPV感染組和NE-HPV組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

圖2不同HPV感染組中宮頸脫落細胞miR-18a的表達

Fig.2 Expression of miR-18a in cervical exfoliated cells of different HPV infection groups

2.3宮頸癌、CIN與對照組宮頸脫落細胞中miR-18a的表達情況

圖3顯示宮頸脫落細胞中，宮頸癌組、CIN組中miR-18a表達水平分別為4.01±0.57、3.22±0.65，較對照組的1.27±0.16呈顯著增高(t值分別為25.02、15.36，均P<0.05)，但宮頸癌組與CIN組兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

注：NE為對照組。

圖3宮頸癌組、CIN組與對照組宮頸脫落細胞中miR-18a的表達

Fig.3 Expression of miR-18a in cervical epithelial cells of cervical cancer group, CIN group and control group

2.4宮頸癌及CIN宮頸脫落細胞中miR-18a的ROC曲線分析

宮頸脫落細胞中miR-18a用于CIN的AUC為0.699，95%置信區間(CI)為0.606～0.791，最優截斷值取0.317，診斷靈敏度為83.3%，特異度為73.6%，P<0.001；用于診斷宮頸癌的AUC為0.801，95%CI為0.724～0.879，最優截斷值取0.483，診斷靈敏度為86.7%，特異度為82.3%，P<0.001，提示宮頸脫落細胞中miR-18a對CIN和宮頸癌具有良好的診斷價值，見圖4。

圖4宮頸脫落細胞中miR-18a表達對CIN(A)和宮頸癌(B)診斷價值的ROC曲線分析

Fig.4 ROC curve analysis of miR-18a expression in cervical exfoliated cells diagnosis of CIN (A) and cervical cancer (B)

3討論

3.1 miRNA可作為高危型HPV感染及宮頸癌發生發展的分子標志物

宮頸癌是目前唯一被世界衛生組織確定為可以通過篩查降低浸潤癌發生率的惡性腫瘤。高危型HPV檢測和宮頸細胞學檢查是目前最主要的兩種宮頸癌篩查方法。HPV檢測具有敏感性高、陰性預測值高、結果客觀可靠等優點，但其最大局限性是陽性預測值低，在HPV檢測結果為陽性的大量人群中，實際發生或將發生CIN或宮頸癌的患者很少[8]。HPV檢測的目的不是篩查HPV感染，而是篩查出高度病變風險的人群[9]，因此，發現與高危型HPV感染及HPV誘導的宮頸病變發展(尤其是宮頸癌)密切有關的分子標記物，對于宮頸癌的早期診斷和預警極為重要。

miRNAs可穩定存在于各種體液中，包括血液、尿液、唾液、分泌物、眼淚、乳汁、支氣管灌洗液、精液、羊水、胸水、腹水、腦脊液等[10]。因此，越來越多的研究致力于將miRNAs作為生物標記物用于疾病的早期臨床診斷。相對于血清標本，宮頸黏液脫落細胞標本來源于宮頸，因此其對宮頸癌更具有特異性。同時，它具備無創、易于取樣、易于檢測等優點，因此宮頸黏液脫落細胞標本中的miRNA可成為早期宮頸癌篩查良好的生物標志物。

3.2 miR-18a通過調控多種靶基因參與調控腫瘤的發生發展

miR-18a來源于miR-17-92基因簇，位于人染色體13q31.3，通過調控多種靶基因參與調控腫瘤的發生發展[11]。有關miR-18a在腫瘤中的作用，有研究認為其可能作為抑癌基因發揮作用，通過調控其下游靶基因K-Ras對腫瘤細胞體外增殖發揮抑制作用，誘導G1期阻滯，促進細胞凋亡，降低腫瘤細胞的轉移[12-13]。而相反研究結果表明在乳腺癌、結直腸癌、膠質母細胞瘤等多種腫瘤中，miR-18a的表達上調。上調的miR-18a通過PTEN-PI3K-AKT-mTOR活化cylinD1促進食管癌細胞的增殖[14]。高表達的miR-18a與鼻咽癌的分期、淋巴結轉移情況密切相關[15]。

3.3 miR-18a表達增高可能參與HPV介導的子宮頸癌的發病機制

我們也在前期預實驗中發現miR-18a表達在大多數宮頸癌組織中明顯高于正常組織，本研究結果顯示，宮頸脫落細胞中miR-18a表達水平在HR-HPV感染組顯著高于LR-HPV感染組及NE-HPV組，而LR-HPV感染組與NE-HPV組間未顯示出顯著差異，提示miR-18a表達水平的增高參與了高危型HPV的感染及對子宮頸癌變的致病過程，具體機制還有待研究。在高危HPV感染的宮頸脫落細胞中，CIN(包括CIN1～3級)及子宮頸癌組中miR-18a水平顯著高于對照組，提示miR-18a表達水平增高可能參與了HPV介導的子宮頸癌的發病機制，并可能直接參與從病毒感染的初始階段向癌前病變及子宮頸癌階段的惡性轉化過程。miR-18a表達水平在宮頸癌組、CIN組中并無顯著性差異，提示一旦發展為癌前病變后，miR-18a表達水平與宮頸癌的發生發展并沒有顯著關聯，但miR-18a和宮頸癌病理學不同發展階段的相關性有待大樣本的進一步研究證實。ROC曲線結果分析miR-18a用于診斷CIN的AUC為0.699，診斷靈敏度為83.3%，特異度為73.6%；用于診斷宮頸癌的AUC為0.801，診斷靈敏度為86.7%，特異度為82.3%，提示宮頸脫落細胞中miR-18a對CIN及宮頸癌具有良好的診斷價值，且宮頸脫落細胞標本易于獲得，具備早期無創、特異性好等優點，有望成為早期宮頸癌篩查良好的生物標志物。