井岡霉素產生菌的誘變選育及發酵條件優化

陸佳斌 王銀泉

摘 要：此次研究主要通過可以吸水的一種鏈霉菌井崗變種作為研究對象，通過硫酸二乙酯以及紫外線進行誘變，并通過平皿進行初步篩選，通過搖瓶進行復篩，從而獲得高效價菌株，且通過實驗研究，此菌株的遺傳性較為穩定，同時通過正交實驗以及單因素實驗對最佳發酵培育基以及發酵條件進行研究和分析。

關鍵詞：井岡霉素;產生菌;誘變選育;發酵條件

中圖分類號：Q933

文獻標識碼：A

農用抗生素是農業常見的應用藥品之一，其主要是由微生物形成的一種次級代謝物，能夠對農業生產過程中出現的有害生物進行有效的防治，從農用抗生素的作用功能方面進行劃分，可分為殺蟲抗生素、防病抗生素以及除草抗生素，隨著我國對這一類藥物的研究不斷深入，目前，已經出現了井岡霉素、武夷霉素、農抗120、瀏陽霉素等一系列農用抗生素。此次研究的井岡霉素主要是在井岡山發現的微生物菌株所形成的一種農用抗生素，主要用于水稻紋枯病、稻瘟病等，由于其具有低毒、高效以及對環境污染小等優點，因此，被人們廣泛應用。然而，此類農用抗生素的生產水平方面仍不高，此問題已經成為當前眾多研究人員研究的重點課題，在研究的過程中，高產菌株的選育便是其中的一有效的方法，并且通過發酵培養基及優化培養條件也能夠提高其生產水平，本文將對這兩方面做出實驗研究。

1?實驗材料

1.1?菌種的選擇

本次實驗所選取的菌種為吸水鏈霉菌井岡變種、水稻紋枯病菌。

1.2?培養基

試管斜面以及孢子活化：高氏Ⅰ號培養基。

發酵培養基：黃豆餅粉3.0%、米粉9.0%、NaCl0.15%、KH2PO40.1%，pH為6.7。

2?實驗方法

2.1?誘變選育法

在誘變操作之前應該對單孢子懸液進行制備，并調整孢子的濃度，濃度為108個/mL。

紫外線誘變：取出制備完成的單孢子懸液，將其置入培養皿之中，并將其放置在攪拌器上面，對培養皿與紫外線燈之間的距離進行調整，距離為30cm，然后將培養皿的皿蓋打開，然后使用攪拌器進行恒速攪拌，同時使用紫外線燈對其進行照射，照射時間選段分別為0、30、60、90、120、150、180s，當照射完畢之后，對孢子懸液進行梯度稀釋，然后進行涂板培養，培養的過程中應該遮蔽光線。

硫酸二乙酯誘變：在紫外線誘變所形成的正變菌株之中選取菌株，保證菌株的效價具備較高的水平，通過此菌株進行硫酸二乙酯誘變，取出最新已制備完畢的出發菌株所形成的孢子懸液，劑量為5mL，將其置入到0.04mL的硫酸二乙酯之中，然后再向其中加入磷酸緩沖液，緩沖液的濃度為0.1mol/L，pH為7.0，劑量為15ml，并將其放置在搖床上，搖床的溫度為37℃，頻率為200r/min，然后分別處理0.2、0.5、1.5、6h，處理完畢之后將濃度為2%的Na2SO3加入其中，然后結束誘變，最后將處理完畢的孢子懸液進行梯度稀釋，并將其涂板培養，培養過程中仍需要注意避光進行。

2.2?測定效價

測定效價（初篩）：將水稻紋枯病菌作為檢定菌。

測定效價（復篩）：測定需要執行《井崗霉素水劑國家標準》（GB/T9553-93），并通過液相色譜法對其效價進行測定。

2.3?效價計算方法

對井崗霉素的效價進行計算的過程中，仍需要執行《井崗霉素水劑國家標準》（GB/T9553-93），并通過液相色譜法對井崗霉素A進行測定，并對試樣進行500倍的稀釋，同時通過ODS-C18色譜柱以及紫外線檢測器分離井崗霉素，并對峰面積應用外標法進行定量，從而使井崗霉素的效價得以算出。

2.4?遺傳穩定性檢測實驗

將通過誘變操作之后形成的高產菌株置于斜面之上，并進行5次的連續傳代，并對其代間效價進行檢測。

3?結果

3.1?菌株誘變選育的結果

3.1.1?紫外線誘變結果

通過對出發菌株采取紫外線誘變之后，如表1所示，當誘變的時間逐漸增加時，菌株出現的致死率會不斷的上升，因此，應該選擇在最短的時間之內對菌株進行誘變選育處理，當完成紫外線誘變之后，通過平板初篩后，出現正變菌株共計73株，然后采取搖瓶發酵的方法進行復篩，通過對效價進行檢測，共計檢測出3株較高效價的菌株，然后進行硫酸二乙酯誘變。

3.1.2?硫酸二乙酯誘變

如表2所示，硫酸二乙酯能夠使菌株很容易致死，通過使用硫酸二乙酯進行為時0.2h的處理之后，菌株的致死率能夠達到92.6%，但隨著時間的增加，致死率雖也在增加，但增加的幅度卻極大的降低，而經過上述的30s內對菌株進行紫外線誘變處理之后，在通過硫酸二乙酯進行誘變處理，從而通過選育能夠形成高產菌株，通過效價計算為25878×10-6g/mL。同時，通過穩定性實驗，結果表明其遺傳穩定性較為良好。

3.2?發酵條件的優化

3.2.1?各類碳源、氮源對井岡霉素能力產生的影響

本次研究主要選取6種碳源對發酵培養基之中的碳源進行了替代，這6種碳源分別為碳酸鈣、牛肉膏、碳酸氫鈉、淀粉、葡萄糖、乳糖，通過實驗可知，淀粉效價可達到28089×10-6g/mL，屬于6種碳源之中最高的一種碳源（培養基碳源米粉為25869×10-6g/mL）。

同樣，此次研究也選取了6種氮源對發酵培養基之中的氮源進行替代，這6種氮源分別為酵母粉、蛋白陳、蠶蛹粉、硝酸鉀、氯化銨以及硝酸銨，其中。酵母粉的效價可達到27.68×10-6g/mL，屬于6種氮源之中最高的一種氮源（培養基氮源黃豆餅粉為25863×10-6g/mL）。

3.2.2?培養基初始的pH對井岡霉素能力產生的影響

為使各初始pH對井岡霉素能力產生的影響進行對比，通過不相同的pH形成的緩沖溶液用于發酵培養基的配制，通過研究可知，當pH=7.2時，菌株具備最強的產素能力，pH值或高或低都不能夠使菌株的產素能力提升，故對pH7.2作為培養基初始的pH。

3.2.3?培養溫度對井岡霉素能力產生的影響

當發酵培養基完成接種之后，將其各置入到溫度為33℃、35℃、37℃、39℃以及41℃的培養溫度環境之中，然后進行搖瓶培養，通過培養結果可知，當培養溫度為37℃的情況下，井岡霉素能力便能夠達到最強狀態。

3.2.4?接種量以及種齡對井岡霉素能力產生的影響

取種齡不同的液體種子參與實驗，種齡可劃分為60h、72h、84h、96h，通過研究，結果表明種齡與井岡霉素能力之間是正相關的關系，同時，將96h種齡的液體種子以8%、10%、12%、14%的接種量用于發酵培養實驗。實驗結果表明，接種量為8%的情況下，井岡霉素的能力最強。

3.2.5?正交試驗

正交試驗依據為L9（34）表，主要對酵母粉、淀粉、NaCl以及KH2PO4這4個因素進行正交試驗。通過實驗結果可得知其最佳發酵培養基為：酵母粉4%、淀粉12%、NaCl為0.15%、KH2PO4為0.05%，其化學效價可以達到29443×10-6g/mL，以極差作為依據進行分析可知，淀粉對井岡霉素，其次具備較大影響的是酵母粉，而NaCl以及KH2PO4對產素方面的能力具有較小的影響。

4?討論

隨著近年來生物學不斷的發展，菌種選育的方法出現了創新，但通過誘變育種這種方法，能夠有效的使產素能力得以提升，本文主要通過紫外線誘變以及硫酸二乙酯誘變對菌株進行誘變，通過2次誘變，能夠將菌株效價提升至25878×10-6g/mL，此效價要比出發菌株高很多，并且在遺傳穩定性方面表現的較為良好。與此同時，在進行液相色譜實驗的過程中，對以往通過稀釋法進行測定過程中產生的誤差大、不易掌握、測時較長等缺陷進行了克服，從而提升產菌的能力。

在誘變選育的前提下，通過培養條件發熱優化、培養基配方以及正交試驗的實施，能夠得出最佳發酵培養基為：酵母粉4%、淀粉12%、NaCl為0.15%、KH2PO4為0.05%，其化學效價可以達到29443×10-6g/mL。從而為井岡霉素的工業生產創造了基礎。

參考文獻

[1] 張茜茜，朱永強，劉華梅，等.井岡霉素高產菌株的復合誘變篩選[J].湖北農業科學，2009，48（3）：612-614.

[2]?覃敬羽，李世杰，劉華梅.井岡霉素高產菌株原生質體誘變篩選研究[J].現代農業科技，2010（22）：38-39.

[3]?趙南，吳冬蘭，唐洪敏，等.氮離子注入井岡霉素產生菌誘變高產菌株的研究[J].江西農業學報，2010，22（4）：122-123.

[4]?廖曉，陶科，侯太平.井岡霉素產生菌的誘變選育及發酵條件優化[J].四川大學學報（自然科學版），2008，45（4）：963-966.

作者簡介：

陸佳斌（1990- ），男，浙江省海寧市人，本科，研究方向：輕化工程;

王銀泉（1962- ），男，浙江省海寧市人，本科，研究方向：生物農藥。