堆肥添加氧化石墨烯和納米SiO2對高羊茅生長的影響

王鑫禹，多立安，趙樹蘭

（天津師范大學 生命科學學院，天津 300387）

生活垃圾堆肥富含有機質、氮、磷、鉀及植物所需的營養元素，能夠提高土壤肥力并刺激植物生長.但由于我國未實行嚴格的垃圾分類處理，生活垃圾堆肥中含有大量的重金屬，這些重金屬極易隨著施肥進入農田土壤且隨土壤徑流污染地表及地下水，從而危及人類健康[1].在土壤重金屬修復中，納米材料由于具有尺寸小、比表面積大、吸附效果好等優點而得以應用[2-4].氧化石墨烯（GO）作為碳納米材料石墨烯的重要衍生物，表面具有豐富的含氧官能團和大的表面積，可以通過配位、靜電作用、表面絡合以及離子交換等結合重金屬離子，在環境污染控制和治理領域發揮著重要作用[5].納米二氧化硅（nano-SiO2）的微結構呈無定形絮狀或網狀結構，也是應用較多的一種無機納米材料[6]，如能夠明顯提升檸檬酸和酒石酸對土壤Pb、Zn和Cd的去除率[7].納米材料也會在一定程度上影響植物生長.有研究[8-10]發現，某些碳納米材料可以刺激作物種子萌發，促進植物根系伸長；有些碳納米材料則對植物生長發育存在負面效應，表現為生長抑制、組織損傷等，如Cakir等[11]研究了氧化石墨烯對豆類種子發芽和幼苗生長的潛在影響，發現氧化石墨烯的存在導致了種子發芽率變小、根與苗的長度變短、質量降低.

在納米材料對植物生長影響的研究中，報道相對較多的是碳納米管[12]，有關氧化石墨烯和納米SiO2的研究較少.本研究選擇氧化石墨烯和納米SiO2為鈍化劑，以我國北方廣泛應用的冷季型草坪草高羊茅（Festucaarundinacea）作為研究對象，探究堆肥基質中添加氧化石墨烯和納米SiO2對高羊茅生長和抗氧化酶活性的影響，為納米材料在堆肥重金屬修復中的應用和納米材料的風險評價提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

氧化石墨烯，蘇州恒球納米公司生產，黑色粉末，平均厚度為 3.4～7.0 nm，片層直徑 10～50 μm，層數 5～10層，比表面積為100～300 m2/g，純度為90%.

納米SiO2，上海麥克林生化公司生產，超微細白色蓬松粉末，比表面積為200 m2/g，粒徑為7～40 nm，純度為99.8%.

生活垃圾堆肥取自天津市小淀生活垃圾堆肥處理廠，過2mm篩備用.基本理化性質：有機質質量分數22.0%，飽和含水量 0.67 mL/g，pH 7.49，全氮 0.58%（質量分數，余同），全磷0.34%，全鉀1.21%，有效磷0.078 g/kg，碳氮比為8.37.草坪植物選用高羊茅.

1.2 實驗設計

采用直徑為7.0 cm、高為7.8 cm的塑料盆.垃圾堆肥自然風干，過2 mm篩.每盆中加入85 g堆肥以及一定質量的GO和納米SiO2，各處理組的具體配比如表1所示.各種配料混合均勻，以不添加GO和納米SiO2為對照，每個處理重復4次.選擇籽粒飽滿、大小均一的高羊茅種子，用體積分數為3%的H2O2表面消毒10 min，無菌水沖洗 3次，每次1～2 min，晾干.每盆堆肥基質表面播撒1 g高羊茅種子進行草坪建植.植物培養期間室內溫度為18～28℃，相對濕度為50%，光照為透入室內的自然光（600～28 000 lx）.每天補充水分，保證土壤含水量為最大持水量的70%，供植物正常生長所需.經常調換花盆位置，保證受光一致.

表1 各處理組中GO和納米SiO2的質量分數Tab.1 Mass fraction of GO and nano-SiO2in each treatment %

1.3 測定指標與方法

1.3.1 植物生長指標測定

播種第25 d開始，每隔5 d測一次株高，每盆隨機選取5株長勢勻稱的植株，取其平均株高.第55 d刈割.刈割后小心掰開盆中堆肥，取出完整植株，蒸餾水沖洗干凈根部泥土后用濾紙吸干，小心分開地上部分與地下部分.再將地上和地下部分分別在108℃下殺青20 min，80℃烘干至恒重并稱量.

1.3.2 葉綠素含量的測定

稱取新鮮葉片0.2 g，剪成1～2 mm碎片，浸泡于丙酮-乙醇的混合溶液（體積比為1∶1）中.浸泡24 h后，用分光光度計測量波長663 nm和645 nm下的吸光值.

1.3.3 丙二醛（MDA）含量及抗氧化酶活性測定

丙二醛含量的測定采用硫代巴比妥酸法，分別測定450、532、600 nm處的吸光值，算出MDA的濃度，再折算成單位鮮重組織中的MDA含量，用每克鮮重中MDA的物質的量（μmol/g）表示.

粗酶液的提取：稱取新鮮葉片0.5 g，分別加入預冷的提取液3 mL和少許石英砂，充分冰浴研磨后轉入離心管中，再用2 mL提取液洗研缽，合并提取液.4℃下10 000 r/min離心20 min，將上清液分裝，4℃保存.

過氧化物酶（POD）活性測定：采用愈創木酚法，測定470 nm處吸光度的變化，以每分鐘內引起470 nm吸光度變化0.01的酶量為1個酶活力單位（U），單位為U/（g·min）.

超氧化歧化酶（SOD）活性測定：采用NBT法，以抑制氮藍四唑（NBT）光還原50%為1個酶活力單位（U），用每克鮮重的酶活力單位數（U/g）表示.

過氧化氫酶（CAT）活性測定：采用紫外分光光度法，于240 nm處測定吸光度變化，以每分鐘內引起240 nm吸光度減少0.1的酶量為1個酶活力單位（U），單位為U/（g·min）.

抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定：以每分鐘氧化1 μmol抗壞血酸的酶量為1個酶活力單位（U），單位為U/（g·min）.

1.3.4 數據處理

采用SPSS 19.0進行單因素方差分析（One way ANOVA），采用Tukey法在P=0.05水平進行數據差異統計學意義檢驗，采用Microsoft Excel 2007作圖.

2 結果與分析

2.1 GO和納米SiO2對高羊茅株高和生物量的影響

堆肥中添加不同比例的GO和納米SiO2后，高羊茅的株高如表2所示.

表2 GO和納米SiO2對高羊茅株高的影響Tab.2 Effects of GO and nano-SiO2on height of Festuca arundinacea cm

由表2可以看出，在整個生長期內，共同添加GO和納米SiO2的處理組株高顯著高于對照組，并且隨著納米SiO2添加量的增加株高增大.在前40 d，單獨添加納米SiO2處理組的株高低于對照組的數值，共同施加GO和納米SiO2的處理組中株高大于對照組的數值.在第50d到第55 d，添加納米SiO2的處理組株高較對照組有顯著增加，且隨著添加量的增加株高有增加趨勢.與單獨添加納米SiO2的處理組相比，添加1.0%GO后株高顯著增加.在整個生長期內，添加GO和0.6%納米SiO2的處理組中高羊茅株高達到最大值，與對照組的差異具有統計學意義（P＜0.05）.

單獨添加0.2%納米SiO2的處理組中，高羊茅地上干重較對照組略有增加，0.6%和0.4%納米SiO2處理組的地上干重相近，略低于對照組的數值，如圖1所示.

圖1 GO和納米SiO2對高羊茅干重的影響Fig.1 Effects of GO and nano-SiO2on dry weight of Festuca arundinacea

堆肥基質中共同施加了GO和納米SiO2后，同對照組或單獨添加納米SiO2的處理組相比，高羊茅地上干重增加并隨著納米SiO2添加量的增加而增加.GO和0.6%納米SiO2處理組中高羊茅的地上干重最大.

除了0.2%納米SiO2處理組的地下干重顯著大于對照組外（P＜0.05），其余處理組的地下干重均與對照組相近.各處理組的地下干重較對照組減少但差異不具有統計學意義（P＞0.05）.

2.2 GO和納米SiO2對高羊茅葉綠素含量的影響

不同處理組中高羊茅的葉綠素含量如表3所示.由表3可以看出，堆肥基質中添加了GO和納米SiO2后，各處理組高羊茅的葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素含量均低于對照組的數值，但差異不具統計學意義（P＞0.05）.單獨添加0.6%納米SiO2的處理組中，高羊茅葉綠素a和總葉綠素含最低，分別比對照組降低了12.77%和9.27%.單獨添加GO的處理組中，高羊茅葉綠素b含量最低，較對照組降低了8.95%.

表3 GO和納米SiO2對高羊茅葉綠素含量的影響Tab.3 Effects of GO and nano-SiO2on chlorophyll content of Festuca arundinacea （mg·g-1）

2.3 GO和納米SiO2對高羊茅MDA含量的影響

不同處理組的高羊茅MDA含量如圖2所示.

圖2 GO和納米SiO2對高羊茅MDA含量的影響Fig.2 Effects of GO and nano-SiO2on MDA content of Festuca arundinacea

由圖2可以看出，添加GO和納米SiO2的7個處理組中，高羊茅的MDA含量顯著增加，分別是對照組的2.89、2.84、2.88、2.90、2.97、2.93、3.09 倍.無論是添加GO還是納米SiO2，都對高羊茅的MDA含量產生了相同的影響，使高羊茅的膜脂過氧化物含量顯著增加.添加了1.0%GO和0.6%納米SiO2處理組中的MDA含量最高.

2.4 GO和納米SiO2對高羊茅抗氧化酶活性的影響

不同處理組中高羊茅的抗氧化酶活性如表4所示.

表4 GO和納米SiO2對高羊茅抗氧化酶活性的影響Tab.4 Effects of GO and nano-SiO2on the antioxidant enzyme activity of Festuca arundinacea

由表4可以看出，單獨添加納米SiO2的處理組中，高羊茅的SOD和CAT活性均高于對照組.堆肥中共同施加了GO和納米SiO2后，這2種酶的活性也高于對照組的數值.隨著納米SiO2添加量的增加，2種酶的活性呈增加趨勢.0.6%納米SiO2處理組中，SOD和CAT活性分別比對照組增加了6.41%和65.18%.

堆肥中添加GO和納米SiO2后，高羊茅的POD和APX活性顯著低于對照組的數值（P＜0.05），隨著GO和納米SiO2添加量的增加，2種酶的活性呈下降趨勢.與單獨添加納米SiO2的處理組相比，添加GO后，POD和APX活性均顯著下降，GO和0.6%納米SiO2處理組中的POD和APX活性分別比對照組降低了39.78%和51.10%.

3 討論與結論

有研究顯示，納米材料對植物生長具有正向調節作用，能夠顯著提高植株的株高、根長、生物量等[8-10].本研究以添加了氧化石墨烯和納米SiO2的堆肥為基質培養高羊茅，結果發現，高羊茅經過55 d的生長，2種鈍化劑都能顯著增加高羊茅的株高，促進高羊茅的生長，在氧化石墨烯和0.6%SiO2的共同作用下，高羊茅株高出現最大值，但是對生物量的影響不顯著.添加GO和納米SiO2后，高羊茅的葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素含量較對照組均略有下降.Zhang等[13]、文雙喜等[14]有類似的研究結果，納米二氧化鈦（TiO2-NPs）處理下蘆葦葉綠素含量均隨處理濃度的升高而下降，且粒徑越小下降幅度越大.也有研究[15]表明，在水稻生育后期補施納米硅肥可直接增強葉片中的葉綠素含量，從而增強光合作用.可見，納米材料對植物葉綠素含量的影響可能與納米材料的種類、濃度、施加時期、植物種類等有關.本研究中，堆肥添加GO和納米SiO2后，高羊茅MDA含量較對照組顯著增加，是對照組的2～3倍，說明添加納米材料后造成了高羊茅細胞膜的過氧化.抗氧化酶系統是植物體重要的防御系統組成成分，為細胞清除活性氧.SOD、POD、APX和CAT等可以作為植物受到脅迫的指示指標[16].在這個過程中，有的抗氧化酶會隨著處理時間的延長出現先升高后降低的變化；有的抗氧化酶會隨著處理時間的延長活性一直降低[17].本研究表明，堆肥中添加了一定量的GO和納米SiO2后，高羊茅的抗氧化酶活性隨之發生變化.SOD和CAT活性隨著納米SiO2添加量的升高而提高，POD和APX活性隨著納米SiO2添加量的升高而降低.結合MDA含量和抗氧化酶活性來看，堆肥中添加納米材料能夠使高羊茅的膜脂過氧化程度加重，MDA含量顯著增加，而POD、APX活性卻較對照組顯著下降，說明添加納米材料影響了高羊茅細胞內蛋白質等物質的合成，造成了抗氧化酶的活性降低[18].王震宇等[19]的研究也發現，多壁碳納米管處理可以誘導SOD活性的升高，提高植物抗氧化的能力.SOD與O2·-作用生成 H2O2和 O2，POD 和 CAT 又可繼續分解H2O2，從而降低植株體內H2O2的濃度，起到保護機體免受活性氧物質傷害的作用.4種抗氧化酶在添加納米材料后產生了不同的變化趨勢，說明細胞通過抗氧化酶的協同作用抵抗氧化脅迫.

綜上所述，本研究以添加了GO和納米SiO2的堆肥為基質培養高羊茅，在一定生長時期內，GO和納米SiO2顯著增加了高羊茅的株高，降低了葉綠素含量.高羊茅的MDA含量顯著增加，POD、APX活性下降，SOD、CAT活性提高.因此認為，GO和納米SiO2可以促進高羊茅的生長，但也對高羊茅產生了一定的脅迫，激活了高羊茅的自我保護機制，在生長期內此脅迫并不影響高羊茅的正常生長發育.