復方微粉ANBP對皮膚創傷早期小鼠FⅦ與ATⅢ含量影響的研究

陳 麗，張逸之，葛金文，趙思如，林飛陽，譚 瀅，周忠志

皮膚作為人體最大最外部的器官具有調節體溫、免疫、分泌和屏障等重要功能，但同時也極易遭受創傷[1]。如何加快并改善皮膚創傷修復逐漸成為人們生活中迫切需要解決的問題和醫學領域的研究熱點。皮膚創傷修復可以大致分成凝血止血期、炎癥反應階段、細胞增殖期和組織重塑期這4個階段[2]。研究表明，凝血止血期的縮短對炎癥反應的發展有重要作用，可減少全身多器官功能障礙綜合征的發生，使創傷傷口加速愈合[3-5]，成為救治創傷患者的重要方法。

復方微粉ANBP是由仙鶴草(A)，乳香(N)，藕節(B)和蒲黃(P)這4種中草藥按一定比例制成的粉末混合物，是治療傷口愈合的經典良方，具有抗炎、鎮痛、止血、凝血的作用。已知仙鶴草和乳香可被用于快速止血，緩解疼痛，傷口愈合和消除炎癥。但關于復方微粉ANBP促進創傷愈合的具體研究機制目前尚未完全清楚。

機體的凝血系統包括凝血和抗凝血兩方面，兩者的共同作用保證機體出血時既可有效止血，又能防止血栓形成堵塞血流，從而維持機體內血液正常的生理流動狀態[6]。本實驗的目的是通過對小鼠背部創面在24h內進行肉眼觀察和檢測血清凝血因子(FⅦ)和抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)的含量變化，為進一步研究復方微粉ANBP對皮膚創傷模型小鼠的凝血與抗凝血功能的影響奠定基礎，完善其對創傷愈合的研究機制。

材料與方法

1 材料與動物模型建立

鼠齡6～8周齡的無特定病原體(SPF級別)雌性C57BL/6小鼠30只，體重18～22g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司供給；水合氯醛(天津市科密歐化學試劑有限公司,250g/瓶，批號Q/12HB 4218-2009；復方微粉ANBP從湖南中醫藥大學第一附屬醫院購買仙鶴草、藕節、乳香和蒲黃4味中藥，制備受專利權保護(201210467065.8)；FⅦ、ATⅢ酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(CSB-E17817m、CSB-EL021079MO)購自武漢華美生物工程有限公司；多功能酶標儀(Enspire,美國Perkinelmer公司生產)；生化培養箱(SPX-250B-2,上海?，敼旧a)；高速冷凍離心機(Z32HK,德國生產)。

建立小鼠背部全層皮膚缺損模型[6]：將30只小鼠隨機分為實驗組(n=15)和對照組(n=15)。腹腔注射10%水合氯醛全身麻醉并維持。于小鼠背部脫毛消毒，用直徑1cm打孔器制備皮膚缺損模型。實驗組小鼠背部傷口予以復方微粉涂撒0.2g，盡量覆蓋全部傷口。對照組不予任何處理。兩組喂食、飲水、環境溫度等其他條件相同。并于傷后1～3h、6h、12～24h(各10只)眼眶取血進行指標檢測。

2 觀察指標及方法

肉眼觀察創面基本情況，用大小、厚度相同的濾紙貼于傷口，通過濾紙浸潤面積來判斷創面滲出及其干燥程度。小鼠全血FⅦ、ATⅢ濃度測定：眼眶取血后在8℃下靜置2h后用低溫離心機4℃ 3 000r/s 離心15min離心取得血清。嚴格按照說明書操作。終止顯色反應后，5min內使用多功能酶標儀測定各孔在450nm波長下的光密度(OD值)。

3 統計學分析

結 果

1 肉眼觀察

由圖1可見，對照組小鼠背部創面在1～3h和6h時并無較大差別，濕潤有少量滲出液體，在12～24h時存在輕微出血。實驗組小鼠背部創面因有復方微粉覆蓋，與對照組相比，在1～3h時液體滲出少，12～24h時創面無出血，粉末貼合，整體情況較對照組良好，而6h時創面較表現最為干燥，滲出最少。

圖1 小鼠背面創面肉眼觀

2 小鼠全血血清FⅦ含量檢測結果

ELISA結果顯示在創傷后24h內，對照組FⅦ含量持續上升。實驗組FⅦ含量先上升后下降，呈開口向下拋物線狀，于6h時達到(97.32±12.11)ng/mL，為觀察期間含量高峰(P<0.05,見圖2，表1)，較對照組(71.09±63.73)ng/mL含量表達增高，而12～24h時為(58.29±18.10)ng/mL，較對照組(89.87±61.34)ng/mL含量表達降低。

3 小鼠全血血清ATⅢ含量檢測結果

ELISA結果表明，對照組與實驗組ATⅢ濃度變化趨勢相同，呈開口向上拋物線狀，6h降至(17.36±7.89)ng/mL，為觀察期間含量表達最低點(P<0.05,見圖3，表1)，較對照組(22.55±6.48)ng/mL含量表達低。

表1 兩組小鼠不同時間點FⅦ與ATⅢ濃度

*代表不同時間組的凝血因子Ⅶ濃度差異有統計學意義

圖2全血血清凝血因子Ⅶ實驗組濃度變化圖

*代表不同時間組的抗凝血酶Ⅲ濃度差異有統計學意義

圖3全血血清抗凝血酶Ⅲ實驗組濃度變化圖

討 論

前期研究發現：(1)復方微粉ANBP具有促進人體皮膚創傷以及糖尿病小鼠創面愈合的療效；(2)復方微粉ANBP具有減輕創面炎癥反應的作用；(3)蛋白質組學分析表明跟凝血相關的蛋白在6h表達增加[7-9]。其中，第3點發現與本次實驗研究結果基本符合。然而關于復方微粉ANBP是否能夠通過影響創傷早期凝血與抗凝血功能尚未有確切研究。本研究通過對C57BL/6小鼠進行急性全層皮膚缺損創傷模型建立，探討復方微粉ANBP對急性大面積創傷FⅦ與ATⅢ的動態影響分析。已知ATⅢ是主要的血漿抗凝物質，在血栓栓塞性疾病的形成和發展過程中起重要作用。當其含量增高時，則起抗凝作用，降低時則起促凝作用。FⅦ作為外源性凝血途徑關鍵因子，其含量與血液凝血狀態呈正相關。

實驗結果表明，肉眼觀察：與對照組相比，實驗組6h時創面滲出液減少，更為干燥，不易出血；12～24h時創面粉末貼合，無出血無滲出。這可能與復方微粉在6h時FⅦ含量增加，之后逐漸降低的同時，ATⅢ含量逐漸上升有關。

FⅦ、ATⅢ含量：對照組FⅦ濃度漸增至12～24h，而實驗組呈開口向下拋物線狀，以6h為高峰出現說明實驗組在創傷發生初時具有一定的促進FⅦ釋放作用；在3～6h具有快速促FⅦ釋放的作用。由此得出復方微粉ANBP可使得FⅦ在創傷修復過程中的高峰期提前，提示藥物可能在創傷早期快速濃聚FⅦ而達到迅速止血目的，而后降低FⅦ濃度并與ATⅢ共同作用避免血栓形成；而兩組ATⅢ濃度變化趨勢均呈開口向上拋物線狀，提示在ATⅢ實驗組中藥物在短時間內起到了一定的抑制抗凝血系統功能的作用。創傷用藥后1～3h 復方微粉分別通過升、降FⅦ或ATⅢ濃度，加速創傷止血進程[10]；至6h時，FⅦ濃度達高峰，ATⅢ濃度至低谷，動態調節FⅦ與ATⅢ濃度控制傷口的出血；至24h使得FⅦ濃度降低的同時調控ATⅢ濃度處于較高水平，從而可能促進止血但又不使其血液處于高凝狀態，防止急性創傷后的血栓形成，避免彌散性血管內凝血(DIC)的發生發展及降低微循環障礙概率，為之后加快愈合而減少瘢痕組織產生奠定基礎[11-12]。

綜上所述，復方微粉ANBP具有在創傷早期先增加FⅦ含量，而后增加ATⅢ含量的作用，也許可以滿足創面早期急需止血和較晚期避免造成DIC前期血液高凝狀態以及血栓等并發癥發生的良好的、目前缺少的愈合特點。但對于其是否能夠通過影響FⅦ及ATⅢ含量表達來對動態調節C57BL/6小鼠的凝血與抗凝血功能起到主要作用仍需進一步研究。這是由于中藥復方內活性成分繁多，互相作用復雜以及靶點多方向性等特點和實驗中存在的偶然誤差的影響，復方微粉ANBP促進創傷愈合的具體機制還需進行更深一步的研究和探討。