響應面法優化藠頭抑菌成分提取工藝

吳 琴，伍 玲，陳 謙，楊 敏，高 鵬，陳 浩，黃 敏

（四川省原子能研究院/輻照保藏四川省重點實驗室，四川成都 610101）

藠頭（Allium chinense），別稱薤，百合科蔥屬植物［1］，廣泛分布于我國南方地區。藠頭富含多種活性物質、維生素、礦物質及人體必需氨基酸，營養價值非常高，是藥食同源珍品，素有“菜中靈芝”之美譽［2］。據李時珍《本草綱目》記載，藠頭具有殺菌、健胃、平喘以及治療心腦血管疾病等功效［3］。現代醫學研究表明，藠頭具有開胃健脾、調節腸道、增進食欲和殺菌止瀉等多種功效［4］，具有很大的開發潛力，已被國家農業部發布的《特色農產品區域布局規劃（2013—2020）》列為重點發展農產品之一。但目前我國的藠頭加工還處于初級階段，多被簡單腌制用以佐餐，產品形式單一，不利于藠頭精深加工產業的發展。通過提取藠頭中的活性物質再加以利用，充分開發其價值，提高其加工附加值，豐富產品形式，對于帶動整個藠頭產業的發展具有重要意義［5］。大量研究表明，藠頭對多種致病菌都有明顯的抑制作用，具有開發抗真菌藥物和食品防腐劑的潛力［6-7］。此前普遍認為，蔥屬植物的主要抑菌成分為含硫化合物——蒜素（allicin），相關研究也主要集中于蒜素的提取及純化等方面［8-10］。我國藥典記載，中藥薤白為新鮮鱗莖用水浸煮或蒸過后干燥而成，中醫臨床上使用的是薤白水煎劑，而經浸煮與干燥加工后，由于揮發性強，含硫化合物在干燥藥材和湯藥中其實已經殘留不多，因此很難說含硫化合物是藠頭的主要抑菌成分［11］。陳艷麗的研究結果表明，以藠頭加工廢棄物為原料獲取的蒜素提取液其抑菌能力不顯著［12］。且有報道表明，藠頭中的皂苷類化合物也具有一定抑菌效果［13］，可見，藠頭的抑菌功效可能是多種成分的共同作用，單獨以蒜素含量作為藠頭抑菌成分提取優化的指標并不適宜，直接以抑菌效果作為其評價指標理應更加可靠。因此，本試驗以藠頭提取液對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑制效果為指標對其提取條件進行研究，通過響應面設計優化藠頭抑菌成分的提取工藝，以期為以藠頭為來源的天然抑菌劑的開發利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮藠頭，購自四川省成都市內農貿市場；纖維素酶［濾紙酶活力≥4萬U/g；CMCNa活力≥100萬U/g；C1酶活力≥3萬U/g，1 g酶粉于50℃、pH值為4.8條件下，1min水解底物（濾紙、CMC、脫脂棉或水楊素）產生1μg葡萄糖的酶量為1個酶活力單位］、中性蛋白酶（酶活≥10萬U/g，1 g固體酶粉在40℃、pH值為7.5條件下，1 min水解酪素產生1μg酪氨酸為1個酶活力單位）和果膠酶（酶活≥3萬U/g，1 g酶粉于50℃、pH值為3.5條件下，1 h催化果膠水解生成1 mg半乳糖醛酸的酶量為1個果膠酶活力單位），均購自于寧夏和氏璧生物技術有限公司；無水乙醇（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、鹽酸（分析純），均購自成都市科龍化工試劑廠；菌種：金黃色葡萄球菌（S.aureus），由筆者所在實驗室保藏；營養瓊脂（NA）培養基，購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

1.2 主要儀器與設備

HH數顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市金城國勝試驗儀器廠）、BSA224S-CW 電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］、Eppendorf centrifuge 5810R 高速離心機（德國Eppendorf股份公司）、ELELA FDU-2110冷凍干燥機（ELELA日本東京理化株式會社）、Mettler-Toledo-S210 pH計［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］、DNP-9272電熱恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 藠頭粗提液的制備［7］將新鮮藠頭清洗除雜，晾干，紫外照射15 min滅菌，用攪拌機破碎，按比例加入提取溶劑混勻，調節混合物pH值，攪拌狀態下水浴浸提一定時間，提取液經4層紗布過濾，8 000 r/min離心5 min，取上清液，即為藠頭粗提液。

1.3.2 抑菌試驗 供試菌種劃線2次，挑取生長旺盛的菌落接種于液體NA培養基中，在溫度為36℃，150 r/min條件下培養24 h。將活化的金黃色葡萄球菌以生理鹽水稀釋成106CFU/mL的菌懸液，取100μL菌懸液涂布于相應培養基平板上，其上間隔均勻放置牛津杯，在牛津杯中分別加入0.2 mL藠頭粗提液，以無菌水為對照，每個樣品重復3次，37℃恒溫培養24 h后，測量抑菌圈直徑［13］。

1.3.3 藠頭預處理方法對其抑菌成分的影響 稱取4份相同質量（50 g）的新鮮藠頭，分別在溫度為4℃條件下冷藏1個月、-18℃冷凍1個月、40℃熱風完全干燥、4%（質量比）NaCl鹽漬處理后真空包裝貯藏1個月，按“1.3.1”節中的方法在相同條件下進行提取，以新鮮藠頭為對照，按“1.3.2”節中的方法測定不同預處理藠頭提取物的抑菌效果。

1.3.4 藠頭抑菌成分提取方法 熱水浸提法：稱取50 g新鮮藠頭，破碎后加入50mL超純水混勻，混合物攪拌狀態下于50℃水浴中保持1 h。

乙醇提取法：稱取50 g新鮮藠頭，破碎后分別加入50 mL濃度為50%（體積比）的乙醇溶液混勻，混合物攪拌狀態下于50℃水浴中保持1 h。

酶輔助提取法：稱取50 g新鮮藠頭，破碎后分別加入50 mL超純水混勻，混合物分別加入藠頭干質量0.5%（質量比）的中性蛋白酶（pH值＝7.5）、纖維素酶（pH值＝4.8）、果膠酶（pH值＝3.5），以0.1 mol/L HCl調節pH值，攪拌狀態下于50℃水浴1 h。

將提取液按“1.3.2”節中所述進行抑菌試驗，考察不同提取方法對藠頭提取物抑菌效果的影響。

1.3.5 果膠酶輔助提取藠頭抑菌成分的單因素試驗 稱取50 g新鮮藠頭，分別考察pH值［3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、自然pH值（6.0）］、果膠酶添加量（0、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、1.0%）、提取時間（30、45、60、75、90 min）、水浴溫度（40、45、50、55、60℃）、料液比［1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5（g∶mL）］對藠頭提取物抑菌效果的影響。

1.3.6 響應面試驗設計 根據單因素試驗結果，選取對提取物抑菌效果影響較為顯著的因素（提取時間、料液比、pH值）為響應變量（表1），以提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小為響應值，利用Design-Expert 8.0軟件中Box-Behnken中心組合試驗設計進行響應面分析，優化藠頭抑菌成分提取的工藝條件，從而得到最佳的提取工藝。

表1 響應面分析因素與水平

1.3.7 數據處理 試驗數據均以“平均值±標準差”表示。采用Oringin 7.5軟件作圖，用Design-Expert 8.0軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 預處理對藠頭提取物抑菌活性的影響

藠頭采收期短，且儲存中容易發芽變質，須進行一定處理以延長其保存期，因此考察不同處理方式及條件對藠頭提取物抑菌活性的影響。

由表2可知，新鮮藠頭對金黃色葡萄球菌有明顯的抑制效果，經冷藏后，抑菌效果稍有下降，而經冷凍、干燥、鹽漬處理后的藠頭，完全沒有抑菌效果，說明藠頭的抑菌成分在冷藏環境下能較好地保存，在冷凍、干燥及鹽漬加工處理過程中極易損失，降低了藠頭的產品附加值。從新鮮藠頭中直接提取抑菌成分加以利用，能更充分發揮其功效，體現其藥食兩用價值。

表2 預處理方式對藠頭提取物抑菌活性的影響

2.2 提取方法對藠頭提取物抑菌效果的影響

不同提取方法得到的提取物成分往往有極大差異，采用常見的熱水浸提法、乙醇提取法、酶輔助提取法對藠頭分別進行提取。由圖1可以看出，在相同條件下，藠頭的果膠酶輔助提取物對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，抑菌圈直徑最大，為25.36 mm，纖維素酶提取物其次，中性蛋白酶提取物與水提取物相差不大，50%乙醇溶液提取物抑菌作用最弱。這是因為藠頭細胞壁主要由纖維素、半纖維素、果膠等物質組成，果膠酶和纖維素酶能極大促進其分解，使藠頭中的抑菌成分更充分快速溶出，粗提物的抑菌性能也隨之提高。藠頭的乙醇提取物抑菌作用較弱，可能是由于藠頭中含有的蛋白質和多糖與乙醇發生沉淀反應，包裹了一定量的抑菌成分，使其難以溶出［14］；也有可能是抑菌成分在50%乙醇溶液中溶解性差，從而降低了抑菌效果。因此，本試驗選擇果膠酶輔助法優化提取藠頭的金黃色葡萄球菌抑菌成分。

2.3 pH值對果膠酶輔助提取藠頭抑菌成分的影響

在選擇果膠酶輔助提取的前提下，考察不同pH值對藠頭提取物抑菌效果的影響。由圖2可知，pH值對藠頭提取物抑菌活性的影響十分明顯，對金黃色葡萄球菌的抑制效果隨著pH值的增加而降低，在pH值為3.0處具有最大抑菌圈直徑，其提取物抑菌效果最強。這是因為果膠酶的最適宜pH值為3.0，在此條件下能最大程度發揮其酶活力，且酸性條件有利于破壞藠頭組織結構，促進抑菌成分溶出。

2.4 果膠酶添加量對藠頭提取物抑菌活性的影響

由圖3可以看出，果膠酶的添加量對藠頭提取物抑菌作用有明顯影響，在一定范圍內，提取物抑菌效果隨果膠酶添加量的增加而增強，當果膠酶添加量為0.7%時有最大抑菌圈直徑，為26.45 mm，當添加量超過0.7%時提取物的抑菌圈直徑增幅不大，說明添加少量的果膠酶就可明顯提高提取物的抑菌性能，從經濟效益方面考慮，最適宜的果膠酶添加量為0.7%。

2.5 提取時間對藠頭提取物抑菌活性的影響

由圖4可以看出，提取時間對藠頭提取物抑菌活性有明顯影響，藠頭提取物對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑隨提取時間的延長而增大，當提取時間達到60 min時，抑菌圈直徑最大，繼續延長提取時間，浸提液中的抑菌成分則開始降解失活，提取液的抑菌性能隨之降低。

2.6 提取溫度對藠頭提取物抑菌活性的影響

在溫度為40、45、50、55、60℃條件下，分別提取藠頭抑菌成分，考察溫度對提取物抑菌效果的影響。由圖5可知，藠頭提取物對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑隨提取溫度的升高而逐漸增大，當提取溫度升高至50℃時，抑菌圈直徑達到最大值，溫度繼續升高，提取液的抑菌性能開始下降。這是因為果膠酶的最適宜使用溫度為50℃，超過酶的最佳使用溫度后，果膠酶因高溫失活，無法發揮其輔助效果。

2.7 料液比對藠頭提取物抑菌效果的影響

由圖6可知，料液比對藠頭提取物抑菌效果的影響十分明顯，抑菌圈直徑隨料液比的增大而增大，當料液比為1 g∶4 mL時，增大趨勢減緩。料液比過大，溶劑回收時間和成本增加，不利于后續工作進行，因此不宜選擇過大料液比。

2.8 響應面試驗結果分析

固定提取溫度為50℃、果膠酶添加量為0.7%，以pH值、提取時間、料液比為自變量，提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑（y）為響應值，采用Design-Expert8.0軟件對試驗數據進行響應面回歸分析。共設17個試驗點，其中12個析因點，5個中心點，每組樣品重復3次［15］。響應面試驗設計及結果見表3，方差分析結果見表4。

經二次回歸擬合后求得響應函數，回歸方程為y＝24.19-0.87A+1.39B+2.38C+0.4AB-0.11AC-0.71BC-1.62A2-1.97B2+1.72C2。

由表4可知，該回歸模型達到極顯著水平（P＜0.01），對提取液抑菌影響程度表現為C＞B＞A，即料液比＞提取時間＞pH值，一次項A、B、C，二次項A2、B2、C2和交互項BC對結果影響極顯著（P＜0.01）。模型的回歸系數（R2）為0.990 3，說明模型擬合度較好。失擬項P＝0.084 7＞0.05，差異不顯著，調整決定系數（＝0.977 7）接近l，變異系數（CV）僅為1.67%，表明該模型方程可用來分析和預測不同提取工藝條件下藠頭提取物抑菌圈直徑的最佳理論值［16］。

表3 響應面試驗設計及結果

根據回歸方程，作出各因素間交互作用對提取物抑菌性能影響的響應面及等高線。由圖7可知，提取時間與料液比之間的交互作用十分顯著，表現為曲線較陡，隨著數值的增加，響應值變化較大。其他因素間交互作用較小。

表4 響應面試驗結果方差分析

Design-Expert8.0分析結果表明，在pH值為3.71，提取時間為62.17 min，料液比為1 g∶5 mL時，可達到提取液對金黃色葡萄球菌的理論最大抑菌圈直徑，為（28.47±0.06）mm。為驗證響應面分析法所得結果的可靠性，采用理論最佳提取條件進行提取試驗，在實際操作過程中將試驗因素調整為pH 值為3.7、提取時間為62 min、料液比為1 g∶5 mL，做3次平行試驗，實際測得藠頭提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為28.42 mm。預測值與實際值相符，證實回歸模型可靠。

3 討論

通過單因素試驗，確定藠頭抑菌成分提取宜選用果膠酶輔助提取法，且提取溫度最佳為50℃、果膠酶添加量達到原料質量的0.7%為宜，再進一步根據響應面分析得出，在果膠酶法提取藠頭抑菌成分時，各因素對提取物抑菌性能的影響表現為料液比＞提取時間＞pH值。應用響應面分析法優化提取工藝參數為料液比為1 g∶5 mL、pH值為3.7、提取時間為62 min，在此條件下得到提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為28.42 mm。研究表明，基于響應面法分析所得的優化藠頭提取抑菌成分工藝參數準確可靠，具有實用價值。以藠頭提取物為原料制備天然抑菌劑還有待進一步研究。