基于激光掃描共聚焦顯微技術的烤煙葉面組織粗糙度參比樣研究和應用

徐昭梅，謝新喬，鄧邵文

［紅塔煙草（集團）有限責任公司，云南玉溪653100］

激光掃描共聚焦顯微技術由顯微鏡光學系統、激光光源、電子攝像和計算機圖像處理系統4個部分組成，其主要的技術優勢是分辨率高、成像速度快、自動化程度高，能獲得連續的光學切片，對較厚（＞10μm）樣品的快速三維重建，可全方位認識樣品組織結構的形貌形態［1］。激光掃描共聚焦顯微技術在冶金、化工、生物、醫學領域應用十分廣泛，能觀測樣品表面的三維微觀形貌特征，并對微觀的形貌參數（如深度、高度、長寬、體積、面積、粗糙度等）進行定量分析，因而激光掃描共聚焦顯微技術可以為煙葉外觀特征的量化研究提供有效手段。

煙葉組織粗糙度與煙葉葉齡、著生部位、品種特性、栽培管理、調制技術、土壤環境和氣候條件等密切相關［2］。王信民等將葉面組織作為外觀區域特征的評價指標之一，葉面組織指煙葉表面狀態及木質化程度給予視覺、觸覺的粒面精細程度和質感，可分為粗糙、較粗糙、較細膩和細膩4個檔次［3］。王亞平等認為，葉片結構與粗糙度密切相關，將葉片結構分解為粗糙度、充實度、彈性、柔軟度等4個因子描述詞，對粗糙度的釋義為通過視覺或觸覺感受到葉片表面細膩、凹凸不平的程度，正常成熟的煙葉，部位越高，細胞結構越緊密，表皮的葉面組織越粗糙［4］。在感官分析技術中，葉面組織的粗糙細膩程度屬于表面幾何質地特性的范疇［5］；粗糙度是作為質地特性的因子之一［6］，而現行標準［7］中對葉面組織粗糙度的規范相對模糊。在機械、紡織領域，粗糙度的表征已取得實質性進展，而在煙葉評級領域［8-9］，對葉面組織粗糙度的量化及量值確定至今仍未見報道［3，10］。因此，本研究針對煙葉表皮的葉面組織參比樣進行系統研究，合理劃分梯度并描述，使用激光掃描共聚焦顯微鏡定量表征葉面微觀形貌，運用心理物理學定律［11］驗證，為煙葉評級從傳統技藝走向科學、成為學科提供參考依據，實現傳統評級可傳承和現代評級可量化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

選用云南玉溪地區的K326全葉位的初烤煙樣品作為參比樣品的供試材料；選用云南玉溪世界煙草品種園種植的紅花大金元、K326、KRK26、NC71、云煙97、中煙100、云煙87和福建三明種植的翠碧1號，收集第9至第10有效葉位的初烤煙樣品作為品種識別的供試材料。

所用儀器為Olympus OLS4100激光掃描共聚焦顯微鏡（Olympus公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 評價小組的成立 依據GB/T 16291.1—2012《感官分析 選拔、培訓與管理評價員一般導則 第1部分：優選評價員》［12］，邀請13位獲得中國標準化研究院感官分析優選評價員資格的評價員組成評價小組。

1.2.2 評價樣品的準備 采集樣品后，將1/3的葉尖部、1/3的葉基部和葉緣去除，制作成8 cm×6 cm的長方形葉片。依據YC/T 291—2009《煙葉分級實驗室環境條件》［13］，進行48 h以上的溫濕平衡，使煙葉水分達到并保持在16%～18%。

1.2.3 粗糙度評價 評價小組通過感官分析技術對參比樣進行多次測試，確定參比樣實物、檔次、特征描述；使用15 cm線性標度對樣品粗糙度進行感覺強度的量化，作為樣品粗糙度的感官標度值；選取葉片中間離主脈約2 cm的位置，避開支脈、殘傷、油印或病斑部分打孔取樣，采用Olympus OLS4100激光掃描共聚焦顯微鏡，放大倍數為20×50，掃描范圍為257μm×257μm，對樣品葉面進行3D形貌觀察及粗糙度參數測量。

利用感官強度值與儀器測量值作斯蒂文心理物理功效回歸分析，即ln S＝ln K+n ln I。其中：S為感覺響應強度（即感官標度值）；K為常數；I為物理刺激強度（即儀器測量值）。驗證粗糙細膩度的感官標度值與儀器測量值之間的相關性。采用SPSS 21.0軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 參比樣的測試

表1為13位評價員對葉面組織粗糙度參比樣品進行Friedman檢驗［14］的測試結果，評價小組經多次測試，將所有樣品的粗糙度劃分成7個檔次。3j（p+1）＝74.26（Ftest為聯合假設檢驗，j、p為自由度，R為常數），查文獻［15］中的表可知α＝0.05、j＝13、p＝7時對應的臨界值為12.37，Ftest＝74.26＞12.37，因此可以判斷7個樣品在整體上是存在顯著差異的，參比樣實物如圖1所示。

表1 葉面組織粗糙度參比樣感官測試結果

2.2 確定參比樣

2.2.1 感官評價 葉面組織粗糙度的7個檔次的描述詞可用細膩、較細膩、稍細膩、中等、稍粗糙、較粗糙和粗糙進行表征；并對每個檔次進行描述性分析；使用15 cm線性標度［16］對樣品進行感覺強度的量化，如表2所示。

2.2.2 形貌觀察 由圖2可知，煙葉表面主要為嵴狀隆起，其中7檔粗糙，6檔較粗糙，6、7檔表面均有尖銳的針狀隆起，5檔稍粗糙，4檔中等，且4、5檔表面有粒狀隆起，3檔稍細膩，2檔較細膩，1檔細膩，且1、2、3檔表面波狀脊隆起較為平緩。1檔細膩，隆起最大高值為18.31μm；2檔較細膩，隆起最高值為29.18μm；3檔稍細膩，隆起最高值為39.12μm；4檔中等，隆起最高值為57.45μm；5檔稍粗糙，隆起最高值為81.65μm；6檔較粗糙，隆起最高值為120.77μm；7檔粗糙，隆起最高值為213.48μm。

由表3可知，7種不同檔次粗糙度的煙葉表面形貌特征參數Sa差異明顯，隨著粗糙度的增強，表面形貌平均高度Sa有上升的趨勢，Sa大小排序如下：7檔（粗糙）＞6檔（較粗糙）＞5檔（稍粗糙）＞4檔（中等）＞3檔（稍細膩）＞2檔（較細膩）＞1檔（細膩），與樣品粗糙度感官評價結果的順序一致。表面形貌高度的尖峭度Sku在各粗糙度檔次之間無顯著差異，3檔（稍細膩）、6檔（較粗糙）和7檔（粗糙）的Sku＜3，表示表面形貌脊狀隆起多為較鈍化的類型；1檔（細膩）、2檔（較細膩）和5檔（稍粗糙）的Sku值接近3，表示表面形貌脊狀隆起較尖銳的類型和較鈍化的類型幾乎一樣多；4檔（中等）的Sku＞3，表示表面形貌脊狀隆起多為較尖銳的類型。

表2 葉面組織粗糙度感官評價

表3 葉面組織粗糙度主要物理參數分析

綜上所述，在4檔（中等）、5檔（稍粗糙）、6檔（較粗糙）和7檔（粗糙）的樣品里，隨著粗糙度的增加，隆起最大高度也有變大的趨勢，說明葉面的隆起最大高度和平均高度Sa對粗糙度貢獻率較大，蠟質層和角質層也起一定的影響作用；在1檔（細膩）、2檔（較細膩）和3檔（稍細膩）的樣品里，由于葉表面無明顯顆粒物，隆起最高值的變化梯度不大，說明葉面的隆起最大高度對粗糙度影響不大，主要是表面形貌平均高度Sa對粗糙度的影響較大。

2.2.3 量值確定

2.2.3.1 相關分析 將儀器測量的粗糙度相關參數與感官標度值做相關分析（表4），篩選特征物理量。

表4 葉面組織粗糙度感官強度與物理參數的相關分析

由表4可知，感官強度與表面形貌平均高度Sa呈極顯著正相關且相關系數達到0.98，感官強度與尖峭度Sku的相關性未達顯著水平。因此將表面形貌平均高度Sa作為葉面組織粗糙度的典型特征指標。

2.2.3.2 斯蒂文心理物理功效函數驗證 心理物理學研究表明，感覺響應強度與物理刺激強度的自然對數值呈線性關系：S＝KIn。將該式轉換為自然對數式，即ln S＝ln K+n ln I，也稱為斯蒂文心理物理功效函數。

以儀器測量值的自然對數（ln Sa）為自變量X、粗糙度感官標度值的自然對數（ln M）為因變量Y，建立的回歸模型如下：

說明樣品的粗糙度感覺量（M）的變化與儀器測量的物理量（Sa）之間符合心理物理學冪定律，在一定程度上說明樣品的選擇和特征參數的甄選是合理的，最終據此建立初烤煙葉面粗糙度參比樣（表5）。

表5 葉面組織粗糙度參比樣體系

2.3 粗糙度在品種識別中的應用

如圖3所示，翠碧1號葉表面隆起有直徑41.26μm、高16.83 μm 的中空圓柱體結構，葉面隆起最大高度為24.66μm；紅花大金元葉面隆起最大高度為28.23μm；KRK26葉面隆起最大高度為32.28μm；NC71葉面隆起最大高度為30.87μm；K326葉面隆起最大高度為25.86μm；云煙87葉面隆起最大高度為26.56μm；云煙97葉面隆起最大高度為40.51μm；中煙100葉面隆起最大高度為45.47μm。

由表6可知，表面形貌高度的尖峭度Sku在各品種的中部初烤煙之間無顯著差異。8種不同品種的中部初烤煙表面形貌粗糙度參數Sa差異明顯，結合圖3的微觀形貌分析，可將8個品種分為5個類型，其中翠碧1號為第1類，屬于細膩檔次，且葉表面有獨特的中空圓柱體結構；紅花大金元和云煙87為第2類，屬于細膩至較細膩檔次；NC71、K326和KRK26為第3類，屬于較細膩至稍細膩檔次；云煙97為第4類，屬于中等檔次，中煙100為第5類，屬于中等至稍粗糙檔次。Sa大小為中煙100＞云煙97＞KRK26＞K326＞NC71＞云 煙87＞紅花大金元＞翠碧1號。

3 結論

采用激光掃描共聚焦顯微鏡對葉面組織的微觀形貌進行觀察，發現煙葉表面存在大量的嵴狀隆起區域，可將煙葉分為細膩、較細膩、稍細膩、中等、稍粗糙、較粗糙和粗糙7個檔次，其粗糙度參數Sa分別為2.95、3.60、4.54、5.56、6.67、8.26、10.34μm?；谛睦砦锢韺W定律建立起了烤煙葉面組織粗糙度參比樣體系，為煙葉評級提供了一把可參考的標尺。不同品種初烤煙的粗糙度也有一定差異，中煙100葉面組織粗糙度最大，翠碧1號葉面組織粗糙度最小且葉表面隆起有直徑41.26μm、高16.83μm的中空圓柱體結構。

表6 不同烤煙品種葉面組織粗糙度的主要物理參數