腹腔注射雞血藤醇提物對黃顙魚免疫相關(guān)指標(biāo)及抗病力的影響

張紅霞，王 洋，楊 廣，曾祥茜，朱國霞，方珍珍，劉晉菘，張寶龍，吳 旋，白東清

（1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院/天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384；2.天津渤海水產(chǎn)研究所，天津 300457；3.天津現(xiàn)代晨輝科技集團有限公司，天津 301800；4.天津市靜海區(qū)畜牧水產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，天津靜海 301600）

雞血藤為豆科密花豆的干燥藤莖，是一味富含黃酮類化合物的中草藥，主要分布于廣東、廣西及云南等地區(qū)［1］。通過現(xiàn)代藥理學(xué)分析可知，雞血藤具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)脂代謝等作用［2-5］。雞血藤成分復(fù)雜，其醇提物的主要活性成分為黃酮。黃酮是一類化合物，普遍具有消除自由基、抑菌抗癌及調(diào)節(jié)脂代謝的活性［6］。可見富含黃酮的雞血藤醇提物具有廣闊的應(yīng)用前景。

黃顙魚屬于鲇形目、鲿科、黃顙魚屬，廣泛分布于我國各大水系之中，是一類小型淡水經(jīng)濟魚類。黃顙魚魚肉氨基酸含量豐富，肉質(zhì)細嫩、味道鮮美、營養(yǎng)價值高、無肌間刺，且具有滋補作用和藥用價值，得到消費者普遍認可，是目前國內(nèi)主要養(yǎng)殖魚類品種之一［7-8］。然而，近年來由于養(yǎng)殖密度增加，黃顙魚疾病頻發(fā)，發(fā)病池塘死亡率高，造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失，制約了黃顙魚養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。基于上述原因，本試驗通過腹腔注射方式探究雞血藤醇提物對黃顙魚非特異性免疫能力與血脂水平的影響，為雞血藤醇提物作為黃顙魚飼料免疫增強劑提供前期數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

同一批次720尾健康全雄黃顙魚，購自天津藍科水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司。初始體質(zhì)量為（34.23±1.43）g，初始體長為（14.12±0.28）cm。雞血藤醇提物粉末，購自西安瑞林生物科技有限公司，使用前用無菌生理鹽水（0.85%）分別稀釋成60、120、240、480、960 mg/L。

飼料采用魚粉、豆粕、花生粕、豆油等原料配制，以上原料均購自天津市天祥水產(chǎn)有限責(zé)任公司。配制的飼料營養(yǎng)組成為：粗蛋白含量38.75%、粗脂肪含量6.23%、粗灰分含量10.13%、粗水分含量6.35%、鈣含量1.26%、磷含量1.90%。

嗜水氣單胞菌由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所贈送。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計及養(yǎng)殖管理 養(yǎng)殖試驗在天津藍科水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司一棟700 m2孵化車間內(nèi)進行，使用直徑1.5m，高度0.75 m的圓形孵化桶18個，將所選取的720尾黃顙魚隨機分為6組，每組設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)養(yǎng)殖40尾魚。其中1組注射生理鹽水1 mL標(biāo)記為Z1，為對照組，其余5組魚分別注射1 mL質(zhì)量濃度為60、120、240、480、960 mg/L的雞血藤醇提物溶液，依次標(biāo)記為Z2、Z3、Z4、Z5、Z6。注射后養(yǎng)殖7 d，每個平行隨機選取10尾魚取血解剖并取相應(yīng)組織，測定各項生理生化指標(biāo)。每個平行取10尾魚繼續(xù)養(yǎng)殖，用于攻毒試驗。養(yǎng)殖期間24 h連續(xù)增氧，每天于09：00、17：00進行投餌，日換水量1/3。

1.2.2 血液及組織采集 養(yǎng)殖7 d后，首先取尾靜脈血，4 500 r/min離心15 min取上清液，制得血清樣品，于-80℃凍存待測。然后在冰浴條件下解剖，取鰓、腦、頭腎、中腎、肝胰臟、脾臟，用鑷子剔除掉結(jié)締組織和脂肪組織后用生理鹽水沖洗干凈，稱取組織0.4 g后加9倍體積的0.85%生理鹽水制成10%的勻漿液，然后在4℃4 000 r/min離心20 min，靜止5 min后，吸取上清液轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，暫存于-80℃超低溫冰箱，用于測定生理生化指標(biāo)。

1.2.3 生理生化指標(biāo)的測定 超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、一氧化氮（NO）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、白蛋白（ALB）、補體C3、免疫球蛋白（IgM）活性均采用南京建成公司試劑盒，依照說明書進行。

1.2.4 攻毒致死率測定 選取注射不同濃度雞血藤醇提物的黃顙魚，每箱取10尾魚，每個處理30尾，按每100 g體質(zhì)量0.2 mL的比例腹腔注射嗜水氣單胞菌菌液（活化好的嗜水氣單胞菌，以無菌PBS緩沖液調(diào)濃度至2×108CFU/mL），繼續(xù)飼養(yǎng)7 d，每天定時記錄各組死亡尾數(shù)情況，試驗結(jié)束后計算各組魚的累計死亡率和免疫保護率。

免疫保護率＝（1-N2/N1）×100%；

累計死亡率＝H2/H1×100%。

式中：N1為對照組死亡率，N2為試驗組死亡率，H1為受感染魚尾數(shù)，H2為終死亡魚尾數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0軟件對原始數(shù)據(jù)進行One-ANOVA處理，以0.05作為差異性顯著水平，表格中試驗數(shù)據(jù)用表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 腹腔注射雞血藤醇提物對黃顙魚生理生化指標(biāo)的影響

2.1.1 雞血藤醇提物對黃顙魚體內(nèi)SOD活性的影響 各組黃顙魚組織中SOD活性從高到低為中腎＞肝胰臟＞頭腎＞鰓＞血清＞脾臟＞腦。與對照組相比，注射雞血藤醇提物相同組織的SOD活力有所提高（表1）。頭腎、脾臟、鰓中SOD活力隨著雞血藤醇提物濃度的增加而上升（P＜0.05）。注射組黃顙魚腦中SOD活力均顯著高于Z1（P＜0.05），試驗組之間變化不明顯（P＞0.05）。Z5和Z6組顯著提高了肝胰臟和中腎中SOD活力（P＜0.05）。其中Z6組中腎和肝胰臟酶活力分別是對照組的1.14倍和1.13倍（P＜0.05）。當(dāng)雞血藤醇提物質(zhì)量濃度增加至960 mg/L（Z6）時，血清SOD活力上升為對照組的1.06倍（P＜0.05）。

表1 雞血藤醇提物對黃顙魚體內(nèi)SOD活性的影響

2.1.2 雞血藤醇提物對黃顙魚體內(nèi)CAT活性的影響 由表2可知，對照組及各處理組黃顙魚體內(nèi)CAT活性均為腦中最高，其次為肝胰臟、鰓、中腎、頭腎和脾臟。除Z2組中腎和腦外，其余注射雞血藤醇提物組的各組織CAT活性均顯著高于對照組（P＜0.05）。隨著雞血藤醇提物濃度的增加，黃顙魚肝胰臟、脾臟、中腎、頭腎和腦中CAT活性逐漸升高，并在Z6組達到最高值。Z6組肝胰臟CAT活性為（198.55±8.56）U/mg蛋白，是對照組的1.93倍（P＜0.05），脾臟CAT活性（7.53±0.91）U/mg蛋白，為對照組的1.75倍（P＜0.05），Z6組中腎、頭腎CAT活力分別上升至對照組的2.44倍和1.80倍（P＜0.05）。Z2～Z5組黃顙魚的鰓和血清中CAT活力均高于對照組，但各組間沒有顯著差異，同樣是在Z6組出現(xiàn)了最高值，CAT活性分別為（106.97±4.63）U/mg蛋白和（74.98±3.13）U/mg蛋白（P＜0.05）。

表2 雞血藤醇提物對黃顙魚體內(nèi)CAT活性的影響

2.1.3 雞血藤醇提物對黃顙魚體內(nèi)MDA含量的影響 由表3可知，注射雞血藤醇提物降低了各組織中MDA的含量，但降低效果在不同組織中略有不同。肝胰臟、鰓和血清中MDA含量隨雞血藤質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，并在Z6組降至最低，分別為（0.32±0.01）、（1.22±0.11）nmol/mg蛋白和（7.72±0.32）nmol/mL（P＜0.05）。但Z3組肝胰臟MDA含量與對照組無顯著差異（P＞0.05）。最低質(zhì)量濃度的雞血藤醇提物（Z2）對中腎和頭腎MDA含量沒有影響（P＞0.05），Z3～Z6組中腎和頭腎MDA含量隨著雞血藤質(zhì)量濃度的增加而降低。Z4～Z6雞血藤處理組脾臟的MDA含量顯著低于對照組（P＜0.05）。Z2、Z4和Z6組腦中MDA含量顯著低于對照組，其中Z6組含量最低，為（8.44±0.70）nmol/mg蛋白（P＜0.05）。而Z3、Z5組腦中MDA含量與對照組無差異（P＞0.05）。

表3 雞血藤醇提物對黃顙魚體內(nèi)MDA含量的影響

2.1.4 雞血藤醇提物對黃顙魚體內(nèi)GSH含量的影響 由表4可知，注射雞血藤醇提物提高了各組織中GSH的含量，中腎除Z5顯著降低外，其余各組與對照組無明顯差別，但提高效果在不同組織中略有不同。肝胰臟、脾臟、頭腎、腦、血清中GSH的含量隨著雞血藤濃度的增加，呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，并在Z6組升至最高，分別為（55.16±1.22）、（36.13±3.55）、（37.83±0.95）、（18.43±7.78）μmol/g蛋白和（321.05±17.73）μmol/mL（P＜0.05）。僅Z5和Z6處理組鰓的GSH含量較對照組有所提高，其中Z6組含量最高（P＜0.05），為（17.05±2.99）μmol/g蛋白，而低濃度組與對照組無顯著差異（P＞0.05）。

表4 雞血藤醇提物對黃顙魚體內(nèi)GSH含量的影響

2.1.5 雞血藤醇提物對黃顙魚體內(nèi)GSH-Px活性的影響由表5可知，注射雞血藤醇提物提高了各組織中GSH-Px的活性。肝胰臟、脾臟、頭腎、腦、血清中GSH-Px活性隨著雞血藤濃度的增加，呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，并在Z6組升至最高，分別為（140.64±21.16）、（23.89±0.17）、（139.44±4.79）、（16.63±3.28）μmol/g蛋白和（89.67±7.46）μmol/mL（P＜0.05）。而中腎在Z5組升至最高，為（54.29±2.21）μmol/g蛋白（P＜0.05）。高濃度雞血藤處理組（Z5～Z6）鰓的GSH-Px活性顯著高于對照組，其中Z6組活性最高，為（18.36±1.28）μmol/g蛋白（P＜0.05），而低濃度組與對照組無顯著差異（P＞0.05）。

2.1.6 雞血藤醇提物對黃顙魚體內(nèi)NO含量的影響 如表6可知，各處理組黃顙魚體內(nèi)NO含量為鰓＞肝胰臟＞血清＞脾臟＞腦＞中腎＞頭腎。注射雞血藤醇提物對各組織及血清中NO含量的影響不同。血清中NO含量隨著雞血藤醇提物濃度的增加呈逐漸上升的趨勢，并在Z5和Z6組達到最高值，分別為（4.84±0.69）、（4.63±0.28）μmol/mL（P＜0.05）。而脾臟、頭腎、鰓、腦中NO含量隨著雞血藤醇提物濃度的增加而均呈逐漸下降的趨勢；Z4組脾臟與Z1組差異最為顯著，下降了30.3%（P＜0.05）；Z6組頭腎NO含量與對照組相比下降了55.6%（P＜0.05）；鰓和腦中NO含量均在Z4、Z5和Z6組中與Z1組相比顯著下降，而Z2、Z3組與對照組相當(dāng)（P＞0.05）。注射雞血藤醇提物對肝胰臟和中腎NO含量無顯著影響（P＞0.05）。

表5 雞血藤醇提物對黃顙魚體內(nèi)GSH-Px活性的影響

表6 雞血藤醇提物對黃顙魚體內(nèi)NO含量的影響

2.1.7 雞血藤醇提物對黃顙魚肝胰臟和血清轉(zhuǎn)氨酶活性的影響 各處理組黃顙魚體內(nèi)2種轉(zhuǎn)氨酶GOT和GPT的活性均為肝臟中較高，而血清中較低。與對照組相比，注射雞血藤醇提物的黃顙魚肝胰臟中GOT、GPT活性均隨著雞血藤濃度的上升而增加，在Z6組達到最高值，分別為（151.44±5.43）IU/g蛋白和（146.78±6.68）IU/g蛋白，為對照組的1.43倍和1.22倍（P＜0.05）。而血清中GOT、GPT活性均隨雞血藤濃度的增加而呈逐漸下降的趨勢，在Z6組降至最低。與對照組（Z1）相比，分別下降了39.6%和48.0%（P＜0.05）。血清中GOT/GPT的比值隨雞血藤醇濃度變化的規(guī)律不明顯，Z2和Z3組略高于對照組，而Z4和Z5組低于對照組，Z6組與對照組接近（P＞0.05）。

表7 雞血藤醇提物對黃顙魚轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

2.1.8 雞血藤醇提物對黃顙魚血清其他免疫相關(guān)指標(biāo)的影響 由表8可知，注射雞血藤醇提物7 d后，黃顙魚血清中補體C3、白蛋白含量隨著雞血藤醇提物濃度的增加而逐漸上升，均在Z6組出現(xiàn)最大值，分別為（183.94±6.20）mg/L和（37.03±2.58）g/L，是對照組的3.12倍和1.74倍（P＜0.05）。注射雞血藤醇提物對黃顙魚血清中球蛋白含量沒有顯著影響（P＞0.05）。

2.1.9 雞血藤醇提物對黃顙魚抗病力的影響 由表9可知，雞血藤醇提物對黃顙魚抗病力的影響，注射雞血藤醇提物顯著降低了嗜水氣單胞菌攻毒黃顙魚的累計死亡率，提高了免疫保護率，且死亡率隨著雞血藤醇提物濃度的增加而下降。最高劑量組Z6組死亡率僅有（42.5±3.45）%，較對照組下降了34.6%（P＜0.05）。免疫保護率隨著雞血藤濃度的增加而上升，在Z6組達到最大值37.0%。

3 討論

生物細胞內(nèi)普遍含有SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶，可以清除細胞代謝過程中產(chǎn)生的自由基，保護細胞生物大分子不受損傷，防止過氧化物MDA等的產(chǎn)生［9-10］。其中，SOD將氧自由基轉(zhuǎn)化為 H2O2，H2O2再被 CAT等轉(zhuǎn)化為H2O［11-12］。GSH-Px可以通過催化谷胱甘肽（GSH），將有毒的過氧化物轉(zhuǎn)化為無毒的羥基化合物，起到保護細胞膜結(jié)構(gòu)和提高抗氧化能力的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射雞血藤醇提物后，黃顙魚血清及各組織中SOD、CAT、GSH-Px活性及GSH、NO含量顯著提高，同時代表脂質(zhì)過氧化的MDA含量下降，表明雞血藤醇提物提高了黃顙魚的抗氧化能力［13］。這可能與雞血藤具有清除自由基和抗氧化的作用相吻合［14-15］。NO是細胞間傳遞信息的重要物質(zhì)之一，并且具有介導(dǎo)炎癥反應(yīng)及細胞免疫等功能［16-17］；機體在炎癥狀態(tài)下，巨噬細胞產(chǎn)生大量NO，與超氧陰離子等氧自由基反應(yīng)，產(chǎn)物對細胞有毒性［18-19］；本試驗中雞血藤醇提物降低了脾臟、頭腎、鰓和腦中NO的含量，說明雞血藤醇提物不會造成由NO引起的組織損傷。雞血藤醇提物小幅度提高了黃顙魚血清中NO含量，可能發(fā)揮積極的免疫調(diào)節(jié)作用。

表8 雞血藤醇提物對黃顙魚血清其他免疫指標(biāo)的影響

表9 雞血藤醇提物對黃顙魚抗病力的影響

腹腔注射雞血藤醇提物降低了黃顙魚肝胰臟及血清轉(zhuǎn)氨酶的活性，并且降低了GOT/GPT比值。GOT和GPT是氨基酸代謝過程中2個重要的氨基轉(zhuǎn)移酶，是鑒定肝損傷的標(biāo)志性指標(biāo)。人類GOT/GPT比值越大時說明肝損傷越發(fā)嚴(yán)重，GOT/GPT比值＞2時為酒精肝，比值＞1時為慢性乙肝。目前魚類GOT/GPT比值與其肝損傷程度的關(guān)系尚不明確，對照組GOT/GPT比值為1.87，注射雞血藤的Z6組為1.75，較對照組有所下降。若參考人類轉(zhuǎn)氨酶比值，說明腹腔注射雞血藤醇提物可以降低肝損傷。雞血藤的護肝作用在哺乳動物中也有報道［20］，但其作用機制還有待深入研究。

腹腔注射雞血藤醇提物增加了黃顙魚血清其他免疫指標(biāo)（補體C3、白蛋白）的水平，并且可以降低嗜水氣單胞菌攻毒后的累計死亡率，提高免疫保護率。魚類屬于低等脊椎動物，其特異性免疫結(jié)構(gòu)尚不完善。補體C3、白蛋白和球蛋白（IgM）是魚體重要的免疫指標(biāo)，其中補體C3含量最多，在多種免疫調(diào)節(jié)中起到關(guān)鍵起始作用［21］。本試驗中黃顙魚血清補體C3含量隨著注射雞血藤濃度的增加而逐漸上升。白蛋白是血漿中含量最多的蛋白質(zhì)，主要承擔(dān)著體內(nèi)貯存運輸、維持血液膠體滲透壓、清除自由基等作用［22］。本試驗中黃顙魚血清白蛋白呈逐漸上升的趨勢，并在Z6組達到最大值。IgM含量在魚類免疫球蛋白中含量最為豐富，注射雞血藤醇提物并未改變血清中球蛋白含量，可見雞血藤主要提高免疫相關(guān)指標(biāo)活性，從而提高黃顙魚的抗病力。

4 結(jié)論

腹腔注射雞血藤醇提物可有效提高黃顙魚免疫力以及抗病力，雞血藤醇提物濃度為960 mg/L效果最好。雞血藤醇提物有望作為免疫增強劑應(yīng)用于黃顙魚養(yǎng)殖中。