核桃青皮提取液在腹瀉小鼠體內的抑菌效果

韓曉云，劉 鵬，王 震，范學紅

（商洛職業技術學院，陜西商洛 726000）

抗生素的應用解決了很多醫學難題，但是正是由于抗生素較好的抑菌效果，使得抗生素被廣泛濫用，從而引發了一系列問題，如耐藥菌的產生。耐藥菌的產生給人類公共衛生及健康造成了巨大的威脅。當前我國抗生素濫用問題尤為嚴重，每年抗生素總用量約占世界的一半，這使得我國病菌耐藥現象也異常廣泛。其中大腸桿菌的耐藥問題不容忽視，其耐藥率在臨床中呈上升趨勢［1］，且多重耐藥檢出率也較高，給臨床治療帶來很大困難［2］。

研究表明，核桃青皮提取物在體外具有較好的抑菌效果［3-5］，但關于其體內抑菌效果試驗研究甚少。為減少抗生素的使用及減緩耐藥菌株的產生，本試驗首次研究核桃青皮乙醇提取物對致病性大腸桿菌O157∶H7腹瀉模型小鼠的體內抑菌效果，為開發新型抗感染藥物提供依據。

1 試驗材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌O157∶H7購自中國普通微生物菌種保藏管理中心；大腸桿菌選擇性培養基（麥康凱瓊脂）、乳酸菌選擇性培養基（MRS瓊脂）、腸桿菌選擇性培養基（VRBDA）及雙歧桿菌選擇性培養基（TPY）均購自青島海博生物技術有限公司。KM小鼠購自陜西省醫學實驗動物中心，保持飼養環境溫度25℃左右，標準小鼠飼料喂養，自由飲水。

PYX-DHS-50X65-BS隔水式電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械有限公司）；ZHCH-C1106B超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）；YKH-I型液體快速混合器（江西醫療器械廠）；YX280型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器（上海三申醫療器械有限公司）；JA2003電子天平（上海衡際科學儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物試驗設計 隨機選取無特定病原體（SPF級）昆明（KM）小鼠60只隨機分為3組，即Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組，每組20只。Ⅱ組、Ⅲ組連續7 d中午灌胃大腸桿菌菌液，灌胃體積為10 mL/kg（菌懸液/小鼠體質量）［6］；空白對照組灌胃等體積生理鹽水。灌胃7 d后，第8天開始治療，Ⅲ組每天灌胃核桃青皮乙醇提取物，Ⅱ組用生理鹽水作對照，持續時間為7 d。試驗設計方案見表1。

表1 小鼠灌胃試驗設計

1.2.2 灌胃液制備

1.2.2.1 大腸桿菌灌胃液的制備 先將大腸桿菌O157∶H7標準菌株進行增菌培養，并繪制菌株的生長曲線圖確定其群體生長的穩定期，取穩定期（16 h）的大腸桿菌菌液5 000mL，在4℃條件下，離心10min后收集菌體，無菌生理鹽水清洗3次后稱質量，向菌體中加入一定體積的無菌生理鹽水，調整菌濃度為108CFU/mL，4℃儲存待用。

1.2.2.2 核桃青皮乙醇提取物治療液的制備 手工剝下新鮮核桃青皮［7］，采用冷凍干燥法進行處理［8］。冷凍條件：壓力為10 Pa，溫度為-45℃，含水率為3.28%。待樣品充分干燥后，進行粉碎并過0.425 mm篩網。稱取冷凍干燥的樣品粉末10.00 g，加入200 mL 95%乙醇溶液，65℃下回流提取2 h，將提取物進行過濾后再濃縮，再將濃縮液用水定容至1 000 mL，相當于生藥含量為10 mg/mL，作為試驗母液。取母液10 mL，用蒸餾水稀釋至生藥含量為1 mg/mL，用于抑菌試驗。

1.2.3 灌胃后小鼠的表象觀測 在對小鼠進行試驗過程中，每天觀察記錄3組小鼠的身體狀況（包括小鼠精神狀態、進食狀況、外觀毛發、糞便形態），用以評價小鼠的表象特征。

1.2.4 小鼠腸道菌群的檢測

1.2.4.1 糞便采集 每天09：00用逼迫法采糞便，輕輕擠尾巴根部直腸末端，待排糞便后收集于無菌管中；糞便混懸液制備：將采集到的糞便進行稱量，再加入相應體積的無菌生理鹽水，在混懸儀上充分混合，制成糞便混懸液；糞便混懸液稀釋：將混懸液進行10倍梯度稀釋，每個稀釋做3個平行。

1.2.4.2 檢測指標及方法 大腸桿菌計數。采用涂布平板法，將10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度糞便稀釋液1 mL均勻涂布于麥康凱瓊脂37℃培養10 h，對平板中的顯金屬光澤的紫色菌落進行計數［9］，計算出1 g糞便中的菌含量（CFU/g），結果以活菌數常用對數值表示［10］。

腸桿菌計數。采用涂布平板法，將10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度糞便稀釋液1 mL均勻涂布于營養瓊脂37℃培養10 h，對顯紅色且有膽鹽沉淀環的菌落計數，計算出1 g糞便中的菌含量（CFU/g），結果以活菌數常用對數值表示。

乳酸菌計數。采用涂布平板法，將10-6、10-7、10-8、10-9、10-10梯度糞便稀釋液1 mL均勻涂布于MRS瓊脂厭氧環境下37℃培養10 h，對平板菌落進行計數，計算出1 g糞便中的菌含量（CFU/g），結果以活菌數常用對數值表示。

雙歧桿菌計數。采用涂布平板法，將10-5、10-6、10-7、10-8、10-9梯度糞便稀釋液1mL均勻涂布于TPY瓊脂厭氧環境下37℃培養10 h，對平板菌落進行計數，計算出1 g糞便中的菌含量（CFU/g），結果以活菌數常用對數值表示。

2 結果與分析

2.1 核桃青皮乙醇提取物對感染大腸桿菌O157∶H7小鼠表象的影響

在灌胃期間，每天觀察試驗小鼠的表象特征。試驗前3 d各組小鼠變化不大，但是在試驗第4天，Ⅱ組和Ⅲ組小鼠出現精神狀態不佳及少量腹瀉現象，且其毛發光澤度較Ⅰ組小鼠明顯暗淡，進食量也顯著減少，此類表象說明小鼠已經發生病變，造模成功。在試驗第8天開始，Ⅲ組小鼠在灌胃核桃青皮乙醇提取物后，病癥較Ⅱ組有所減輕，進食量也有所增加。這說明核桃青皮乙醇提取物對治療感染大腸桿菌O157∶H7的小鼠有一定的抑菌療效。

2.2 核桃青皮乙醇提取物對感染大腸桿菌O157∶H7小鼠腸道微生物數量的影響

2.2.1 核桃青皮乙醇提取物對感染大腸桿菌O157∶H7小鼠腸道大腸桿菌數量的影響 從圖1中可以看出，Ⅰ組小鼠體內大腸桿菌數量在試驗期間波動不大，而Ⅱ組與Ⅲ組出現了明顯的變化。在灌胃第3天后，Ⅱ組與Ⅲ組的小鼠腸道內的大腸桿菌數量開始增多，并在灌胃7 d后，出現了升高約3個數量級的差異。這可能是由于大腸桿菌作為生物腸道內的條件致病菌，雖在機體正常情況下，對人體無害，但是當機體菌群失調后，它們會隨即轉為有害菌開始對機體造成威脅，使機體出現腸胃生理功能紊亂的癥狀。另在開始進行核桃青皮乙醇提取物灌胃治療后，Ⅲ組小鼠腸道內大腸桿菌數量開始減少，并在治療后第4天數量大幅下降，達到了Ⅰ組的正常水平，與Ⅱ組小鼠腸內狀況有顯著差異（P＜0.05）。此結果說明核桃青皮乙醇提取物對腸道內致病性大腸桿菌有一定的抑制或殺滅作用。

2.2.2 核桃青皮乙醇提取物對感染大腸桿菌O157∶H7小鼠腸桿菌數量的影響 從圖2中可以看出，Ⅰ組小鼠體內腸桿菌數量相對較低，且在試驗期間一直維持在同一水平，而Ⅱ組與Ⅲ組均出現了明顯的變化。在灌胃后第2天Ⅱ組與Ⅲ組的小鼠腸道內的腸桿菌數量開始增多，之后每天腸桿菌檢出數量都在增多，并在灌胃7 d后達到最高，升高了約4個數量級。這主要是由于腸桿菌中如變形桿菌等大多屬于條件致病菌，當機體由于進入大量致病菌大腸桿菌O157∶H7時，小鼠腸道內條件致病菌由正常菌群變成致病菌，一方面通過營養競爭，另一方面通過釋放胺等物質發揮生物拮抗作用，最終使得益生菌數量大大減少。在開始藥物治療后，Ⅲ組小鼠腸道內腸桿菌數量于試驗第9天開始下降，并在藥物灌胃第15天達到Ⅰ組的正常水平，與未進行治療的Ⅱ組小鼠腸道狀況形成了顯著差異（P＜0.05）。此結果說明核桃青皮乙醇提取物對腸道內腸桿菌有一定的抑制或殺滅作用。

2.2.3 核桃青皮乙醇提取物對感染大腸桿菌O157∶H7小鼠腸道乳酸菌的影響 從圖3中可以看出，Ⅰ組小鼠體內乳酸菌數量相對較高，且在試驗期間波動不大，而Ⅱ組與Ⅲ組同樣出現了明顯的變化。在灌胃后第2天Ⅱ組與Ⅲ組的小鼠腸道內的乳酸菌數量開始減少，之后每天檢出數量都在減少，并在灌胃7 d后乳酸菌減少了2個數量級。這也主要是由于致病性大腸桿菌的增多導致了腸道內環境的微生態平衡遭到破壞，使得乳酸菌等益生菌的生長繁殖因為營養競爭等關系受到抑制。圖3顯示，在進行核桃青皮乙醇提取物進行灌胃后Ⅱ組與Ⅲ組的小鼠腸道內乳酸菌的數量也沒有恢復如初，與Ⅰ組的小鼠腸道乳酸菌狀況有顯著差異（P＜0.05）。這可能是由于核桃青皮乙醇提取物對腸道菌群有廣譜抑菌效果，在抑制致病菌、條件致病菌的過程中，對腸道益生菌也起了抑制作用。

2.2.4 核桃青皮乙醇提取物對感染大腸桿菌O157∶H7小鼠腸道雙歧桿菌的影響 由圖4可知，Ⅰ組小鼠腸道內雙歧桿菌數量相對穩定，與Ⅰ相比，Ⅱ與Ⅲ組在對小鼠進行大腸桿菌O157∶H7灌胃期間，小鼠腸道內雙歧桿菌數量在逐漸下降，且灌胃時間越長，數量減少得越多，這主要是由于大腸桿菌灌胃后，短時間大腸桿菌數量急劇增多，破壞了小鼠腸道內的微環境，取代了腸道內最初優勢菌，成為最新優勢菌，并通過營養競爭抑制了雙歧桿菌的生長繁殖。進行核桃青皮乙醇提取物藥物治療后，雙歧桿菌數量也未能明顯增加，這可能是由于核桃青皮乙醇提取物具有廣譜抑菌作用，對雙歧桿菌的生長繁殖也發揮了抑制作用導致的結果。

3 結論與討論

呂海寧等研究發現核桃青皮對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌具有顯著的抑菌活性［11］，張衛星等研究表明核桃青皮提取物具有抗菌和抗氧化活性［12-13］，丁存寶等研究發現，核桃青皮烘干粉末95%乙醇萃取液對白色葡萄球菌、傷寒桿菌具有一定的抑菌作用［14］。唐春麗等研究發現核桃青皮提取物具有很強的抗菌和抗真菌效果［15-16］。本試驗首先對小鼠進行大腸桿菌O157∶H7灌胃造模，在造模第4天試驗小鼠出現病癥，說明造模成功。隨后用核桃青皮乙醇提取物進行灌胃治療，小鼠病癥減輕。試驗期間對小鼠腸道內大腸桿菌、腸桿菌等條件致病菌的數量進行計數，結果表明在進行大腸桿菌O157∶H7灌胃期間，條件致病菌數量呈上升趨勢，且上升明顯，但在進行核桃青皮乙醇提取液灌胃治療后，條件致病菌數量開始下降，且在灌胃7 d后回到初始水平，與Ⅰ組小鼠無差異。小鼠臨床病癥及體內條件致病菌數量的檢測結果都說明該提取物對治療大腸桿菌O157∶H7感染引起的腹瀉有一定的療效，這與前人的體外試驗有抑菌作用的結果相一致。但是核桃青皮提取物治療腹瀉的機制是否是由單一的抑菌效果所導致的，又或者通過刺激腸道黏膜增強黏膜相關免疫的屏障作用來協同抑菌的，還須要做深入研究。

乳酸菌、雙歧桿菌等屬于生物腸道中益生菌，他們的存在可以增強腸道黏膜免疫屏障作用，調節免疫系統，預防和治療腸道感染。須要注意的是，試驗期間對小鼠腸道內乳酸菌、雙歧桿菌等益生菌的數量進行計數，結果表明在進行大腸桿菌O157∶H7灌胃期間，乳酸菌、雙歧桿菌等益生菌數量呈下升趨勢，且下降明顯，且在進行核桃青皮乙醇提取液灌胃治療后，益生菌數量下降趨勢得到一定的改善，但在灌胃治療7 d后，益生菌數量亦沒有顯著提升，與Ⅰ組小鼠體內益生菌熟練形成顯著差異，這說明該提取物具有廣譜抗菌作用，在抑制大腸桿菌O157∶H7生長繁殖的同時，對腸道內益生菌也發揮了抑制作用。因此核桃青皮乙醇提取液在以后用作新興醫療抗感染藥物時要考慮聯合使用益生菌產品，來幫助病人的腸道微生態環境盡快恢復平衡［17］。