優化18F-FHBG自動化合成方法及其質量評估

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(1.鄭州大學第一附屬醫院核醫學科，河南 鄭州 450052；2.河南省分子影像醫學重點實驗室，河南 鄭州 450052)

核素報告基因顯像是監測機體細胞內、外源性基因表達最具潛力的方法之一，其中最關鍵點是報告基因和放射性藥物(報告探針)的選擇。單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV1-tk基因)是最常用的報告基因之一[1]，而18F-FHBG為檢測HSV1-tk基因表達最具特異性的顯像劑之一[2]。18F-FHBG的主要優點是在HSV1-tk非表達細胞中濃聚較少，而在靶器官表達顯著；但其制備過程復雜，且產率較低。為減少合成時間，提高18F-FHBG產率，本研究對洗脫方法和純化方法進行改進，用全自動合成一鍋法[3-4]和SEP-PAK C18[5]小柱固相萃取法合成正電子示蹤劑18F-FHBG；并對合成產物進行質量鑒定，分析純化后的產物在健康昆明小鼠體內的生物分布，并觀察其在健康新西蘭大白兔體內的PET/CT顯像特征，評估采用改進方法合成的18F-FHBG的質量穩定性，為下一步高效合成18F-FHBG進行HSV1-tk/18F-FHBG核素報告基因顯像研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 隨機選取健康昆明小鼠20只[合格證號SCXK(豫)2017-0004]，雄性，6～8周，體質量25.5～30.5 g，平均(28.00±2.50)g，用于觀察18F-FHBG生物學分布；選取健康新西蘭大白兔4只[合格證號SCXK(豫)2017-0008]，雄性，體質量2.0～3.0 kg，平均(2.50±0.50)kg，用于觀察18F-FHBG PET/CT顯像特征；均購自河南省實驗動物中心。本實驗通過鄭州大學倫理委員會批準。

1.2 試劑 美國藥典級乙醇(US pharmacopoeia，USP Milliper公司)；前體N2-(對甲氧苯基二苯基甲基)-9-[(4-甲苯磺酰基)-3-對甲氧苯基二苯基甲氧基-甲基丁基]鳥嘌呤；HCl、NaOH、Buffer(北京化學試劑廠)；H218O(豐度97%)以及無水乙腈等。

1.3 儀器 醫用回旋加速器(Sumitomo HM-20S)；多功能模塊(住友CFN-multi-p100)；CFN-multi-P100(配備Allrtech 626雙泵和UVSI 200全波長紫外檢測器，Grace Alltima C18 HPLC柱)；Sep-Pak C18及QMA柱(Waters公司)；IC-H柱(Alltech公司)；PET/CT成像系統(Siemens Biography True Point 64 52環)；Syngo工作站(Siemens True D融合軟件)。

1.4 合成方法 采用住友合成模塊合成18F-FHBG，自行設計流程。合成反應開始前，將所有試劑加于預先設計的相應位置，用回旋加速器加速質子轟擊 H218O，經18O(p，n)反應生成18F-；18F-在He氣的作用下通過SEP-PAK QMA陰離子小柱并被QMA柱捕獲，在真空泵的作用下將0.7 ml kryptofix2.2.2和0.2 ml碳酸鉀混合溶液倒吸通過QMA柱，將18F-洗脫注入反應瓶。為保證加入前體前是絕對無水環境，將反應瓶加熱至120℃，持續6～8 min，隨后加入1.0 ml乙腈溶液，加熱至100℃，持續5 min，完成2次除水。

將0.75 ml前體N2-(對甲氧苯基二苯基甲基)-9-[4-甲苯磺酰基]-3-對甲氧苯基二苯基甲氧基-甲基丁基]鳥嘌呤溶液加入反應瓶，加熱至120℃，反應持續8 min，此過程中前體與18F-發生親核取代反應，完成后冷卻濃縮反應液。將0.75 ml鹽酸溶液加入到反應瓶中，加熱至95℃，持續5 min，完成水解反應，此時混合液pH值為酸性且含有雜質，需進一步中和及純化。加入0.5 ml NaOH和1.0 ml磷酸二氫鈉緩沖液(Buffer)混合液于反應瓶中，中和產物混合液，產物混合液通過SEP-PAK C18小柱時可吸附于小柱上。以預先備好的乙醇通過C18小柱洗脫產物，于產物瓶中注入生理鹽水稀釋18F-FHBG，經無菌濾膜濾過備用，制成注射液。

1.5 放射化學純度和體外穩定性檢測 采用HPLC法測定18F-FHBG注射液的化學純度和放射化學純度。HPLC分析條件：C18分析柱，流動相為 3 mmol/L NaH2PO4的10%乙醇溶液，流速為1 ml/min，紫外(UV)檢測波長為254 nm[5]。

1.6 動物實驗

1.6.1 生物分布實驗 將20只健康昆明小鼠隨機分成4組，每組5只。經尾靜脈注射放射性藥物18F-FHBG注射液(5.55 MBq)約0.1 ml，分別在給藥后5、30、60、120 min采用斷脊法處死小鼠，取心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、胃、小腸、股骨、肌肉、腦和血液樣本分別置于試管中，以天平稱重，并用井型γ探測器測其放射性計數，經衰減校正后，計算單位組織攝取率(每克組織占注射劑量的百分比，單位%ID/g)。

1.6.2 活體PET/CT顯像 對4只新西蘭大白兔經肌肉注射2%戊巴比妥鈉1 ml/kg體質量[6]，待其進入深度麻醉狀態后，經耳緣靜脈注入0.2 ml18F-FHBG注射液(11.1～14.8 MBq/kg體質量)，分別在給藥后10、30、60、90、120 min進行PET/CT掃描，3分鐘/床位，經Syngo工作站處理獲得PET/CT圖像。

表1 正常昆明小鼠不同部位生物分布結果(%ID/g，±s)

表1 正常昆明小鼠不同部位生物分布結果(%ID/g，±s)

部位放射性攝取率5 min30 min60 min120 min心臟0.033±0.0090.022±0.0070.020±0.0070.015±0.002肺臟0.057±0.0090.049±0.0040.047±0.0080.034±0.005肝臟0.074±0.0080.070±0.0040.049±0.0060.017±0.004脾臟0.059±0.0080.048±0.0050.036±0.0040.016±0.002腎臟0.271±0.0030.370±0.0090.490±0.0040.460±0.003胃0.062±0.0020.064±0.0040.070±0.0020.046±0.009小腸0.052±0.0080.086±0.0060.167±0.0110.157±0.018股骨0.019±0.0020.018±0.0050.017±0.0040.002±0.002肌肉0.020±0.0030.019±0.0040.002±0.0010.002±0.002腦0.019±0.0020.017±0.0030.016±0.0020.015±0.003血液0.243±0.0800.050±0.0220.006±0.0030.004±0.002

圖1 18F-FHBG的HPLC質量控制圖譜 A.紫外峰，UA=254 nm； B.放射峰，tR=2.5 min

2 結果

2.118F-FHBG合成及質量控制指標18F-FHBG自動化合成時間為19～25 min。獲得的18F-FHBG產品為無色溶液，pH≈7.0，放射性濃度>70 MBq/ml。18F-FHBG未校正的合成效率為(19.00±5.00)%(n>10)。產品經放射層析圖譜分析，結果呈現單峰，與標準品19F-FHBG保留時間(retention time, tR)一致，均為tR=2.5 min；經紫外層析圖譜分析，只發現溶劑峰，未發現前體峰，即HPLC法測定注射液中18F-FHBG的放射化學純度>99%。見圖1。

2.218F-FHBG的體外穩定性檢測 將18F-FHBG產品在生理鹽水和血清中稀釋，測定正電子示蹤劑的穩定性。采用生理鹽水稀釋18F-FHBG產品，室溫放置5、30、60、90、120 min及6 h后其放射化學純度分別為(98.31±0.64)%、(98.08±0.83)%、(97.40±0.69)%、(97.21±0.53)%、(97.23±0.52)%及(97.24±0.61)%；采用血清稀釋18F-FHBG，室溫放置5、30、60、90、120 min及6 h后其放射化學純度分別為(98.07±0.68)%、(98.02±0.82)%、(97.33±0.59)%、(97.12±0.51)%、(97.13±0.54)%及(96.96±0.62)%。在生理鹽水和血清中，6 h內18F-FHBG放射化學純度均未明顯減低，可滿足進一步研究需要。

2.3 生物分布結果 在小鼠血液中，注射18F-FHBG 5 min時攝取率最高，為(0.243±0.080)%ID/g，之后快速下降，30 min時下降至(0.050±0.022)%ID/g，120 min時接近本底水平。在小鼠心臟、肝臟、肺臟和脾臟中，注射18F-FHBG 5 min時攝取率最高，隨時間延長而逐漸降低，120 min下降至觀察時間的最低值。在小鼠胃和小腸中，注射18F-FHBG 60 min時攝取率最高，之后逐漸下降。在小鼠腎臟中，注射18F-FHBG 60 min時攝取率最高。小鼠股骨和肌肉對18F-FHBG的攝取率較低。小鼠腦組織對18F-FHBG的攝取率也較低，且在120 min內無明顯變化。見表1。

2.4 活體PET/CT顯像結果 新西蘭大白兔PET/CT結果表明，注射18F-FHBG 10、30、60、90及120 min時，放射性分布較高的分別為膀胱、腎臟、腸道及肝膽。圖2為注射18F-FHBG 10 min時，放射性分布已遍及兔全身，肝膽、腎臟及腸道已開始顯像；與其他顯像時間相比，注射18F-FHBG 10 min時腎臟顯像最明顯，此后隨時間延長其代謝逐漸減弱。圖3為注射18F-FHBG 30 min時，腎臟顯像已逐漸減少，腸道及肝膽顯像逐漸增強；圖4為注射18F-FHBG 60 min時，腎臟顯像更弱，空腸、回腸顯像逐漸減弱，而盲腸、乙狀結腸顯像逐漸增加。圖5為注射18F-FHBG 90 min時，腎臟已幾乎不顯像，空腸、回腸顯像減弱更加明顯，盲腸顯像逐漸增強。圖6為注射18F-FHBG 120 min時，盲腸顯像最明顯，其他器官幾乎不顯像。在整個放射性顯像過程中，由于血液清除速率快，使顯像過程中本底較低，其他器官顯像明顯，對比效果較好。

3 討論

18F-FHBG的合成方法包括一鍋法[5，7]和二鍋法[8-9]，一鍋法是在同一反應瓶中完成親核、水解、中和三步反應；二鍋法是將相應的反應分步完成，然后將生成的中間體轉移到同一反應瓶中進行后續反應。目前較少采用二鍋合成法合成18F-FHBG。Shiue等[5]采用手動一鍋法合成18F-FHBG，所得產物產率較高，且放射化學純度>97%，但手動合成會導致操作者輻射劑量增多，分裝放射性藥物時，手部是全身受輻射劑量最高部位[10]。有學者[9]提出全自動一鍋合成法。本研究采用全自動合成模塊合成18F-FHBG，不僅可減少操作者輻射劑量，而且合成效率高，可重復性強。

為減少反應時間、增加18F-FHBG產率，本研究主要對2個方面進行改進：①產物洗脫液；②采用純化方法。傳統洗脫液包含二氯甲烷、0.1%三乙胺和5%～10%乙醇；洗脫產物后，需分洗脫液與產物。有學者[11]采用傳統洗脫液洗脫產物，合成時間相對較長。本研究采用乙醇代替傳統洗脫液，產物18F-FHBG吸附在SEP-PAK C18小柱后，直接用乙醇將18F-FHBG從小柱中洗脫，不需蒸發乙醇溶劑，溶液經生理鹽水稀釋后獲得18F-FHBG混合液，可直接用于后續動物活體實驗。產物18F-FHBG混合液的純化方法包括HPLC[6,8]和SEP-PAK C18[8,12]固相萃取方法。有學者[6]同時采用上述2種純化方法，對比發現采用SEP-PAK C18固相萃取方法獲得的產物產率高于HPLC純化法，合成時間自90 min縮短至60 min。本研究采用SEP-PAK C18固相萃取法純化產物，操作簡單，純化過程時間短，合成效率明顯提升，產品合成時間為23～26 min，未校正的合成效率為(19.00±5.00)%。

圖2 注射18F-FHBG 10 min時正常新西蘭大白兔全身顯像 A～F.放射性分布已遍及全身，肝膽、腎臟、腸道已開始顯像 圖3 注射18F-FHBG 30 min時正常新西蘭大白兔全身顯像情況 A～F.腎臟顯像已逐漸減少，腸道及肝膽顯像逐漸增強 圖4 注射18F-FHBG 60 min時正常新西蘭大白兔全身顯像情況 A～F.腎臟顯像更弱，空腸、回腸顯像逐漸減弱，而盲腸、乙狀結腸顯像逐漸增加

圖5 注射18F-FHBG 90 min時正常新西蘭大白兔全身顯像情況 A～F.腎臟已幾乎不顯影，空腸、回腸顯影也更弱，盲腸顯影逐漸增強 圖6 注射18F-FHBG 120 min時正常新西蘭大白兔全身顯像情況 A～F.盲腸顯影最明顯，其他器官幾乎不顯影

本研究中18F-FHBG在正常昆明小鼠體內的生物學分布結果及新西蘭大白兔全身PET/CT顯像結果與既往研究[12]結果一致。對動物注射18F-FHBG混合液后，18F-FHBG在血液中的清除速率較快，顯像時可增加圖像對比度。骨骼、肌肉對18F-FHBG攝取較少，且隨時間延遲攝取率逐漸降低，提示后期顯像研究中本底較低，靶/非靶的比值增加，有利于觀察病灶。18F-FHBG在小鼠腎臟內分布最多，表明藥物主要經過泌尿系統排泄，推測該示蹤劑用于泌尿系統研究時可受到一定程度的影響。胃腸道是18F-FHBG體內排泄的另一途徑。18F-FHBG在小鼠腦組織中的攝取率極少，且隨時間變化改變較小，提示18F-FHBG可能無法通過血腦屏障，用于觀察血腦屏障破壞的疾病時對比效果可能較好。