自噬基因LC3、Beclin1在子宮內膜異位癥中的表達及意義

隋曉宇 張貴宇 劉 堯 楊兆杰

（1 山東大學，山東 濟南 250000；2 山東大學齊魯醫院婦產科，山東 濟南250012；3 齊齊哈爾醫學院附屬第一醫院婦產科，黑龍江 齊齊哈爾 161041）

子宮內膜異位癥（endometriosis，EMs）是育齡婦女高風險和常見的疾病，是指具有活性的子宮內膜細胞種植在卵巢、腹膜、膀胱、直腸等部位，從而導致下腹痛、不孕等癥狀。EMs具有與惡性腫瘤類似生長特性，治療棘手。近年來，該病發病率逐年上升，達10%～20%，不孕婦女中，發病率可達30%～40%[1]。由于EMs的內膜細胞無限制生長，向周邊浸潤，可造成廣泛的粘連，且具有遠處轉移、復發率高、疼痛等特點，因此被稱為婦科“良性癌”。

目前，EMs發病機制研究不明，存在多種學說，如經血逆流、化生內膜、良性轉移、免疫防御功能缺陷、醫源性內膜移植學說等。“經血逆流”學說是目前廣泛受到認可的理論，經期中發生逆流的經血會使子宮內膜組織發生異位，此時若機體局部的免疫應答出現異常、就會造成EMS的發生。近年來，郎景和又提出了“在位內膜決定論”，他認為在位內膜的生理特征異常是EMs發生的直接影響因素，在位內膜的周圍微觀結構及成分則是影響EMs發病及進展的關鍵因素[2]。

臨床采用內分泌及手術為主的方法治療EMs，但效果均不理想。目前發現自噬的調控機制在EMs的發生發展中有一定作用[3]。自噬調節與多種自噬基因有關，微管相關蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）和Beclin-1是目前所知的調控自噬的重要基因。本研究通過檢測LC3、Beclin1在EMs和正常人的腹腔液、血清以及子宮內膜組織中的表達，探討LC3、Beclin1在EMs發生發展中所起的作用及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料：選擇2016年1月至2017年12月期間入住我院的EMs患者和非EMs患者。EMs組共42例，年齡21～42歲，平均年齡（29.5±6.0）歲；同期住院的非EMs患者共42例，年齡18～40歲，平均年齡（31.5±5.0）歲，兩組年齡差異無統計學意義（P＞0.05）。兩組患者平均月經周期（28.59±3.27）d，平均經期（6.45±0.50）d。

1.2 方法

1.2.1 標本采集：抽取兩組患者空腹外周靜脈血5 mL，12000 r/min，離心10 min，用移液器取上清液移至高壓滅菌過的1.5 mL EP管中，保存至-20 ℃冰箱，在腹腔鏡下抽吸沒被血液污染的腹腔液，3000 r/min，離心10 min，取上清液置于-20 ℃冰箱保存。子宮內膜組織的采集，患者在月經后3～7 d用一次性子宮內膜吸引器吸取少量子宮內膜，取增生期子宮內膜，將新鮮的子宮內膜組織經RNAlater處理后放入液氮中快速冷卻，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 酶聯免疫吸附法（ELISA）：提取各組血清4 ℃ 12000 rpm/min離心10 min，提取腹腔液上清液，4 ℃ 3000 rpm/min離心10 min后，取上清液移至1.5 mL離心管中，分別檢測LC3和Beclin1的濃度。最后用酶標儀在波長為450 nm處測定吸光度值（OD），將零孔設為對照孔，繪制標準曲線，曲線的縱坐標設為OD值，而曲線橫坐標設為濃度大小，依據樣品的OD在坐標上找出相應的濃度。標準品用于做復孔檢測，取均值計算直線相關方程系數，從而建立標準方程。每個樣品均做復孔，取均值并記錄，代入上述的回歸方程中計算出各樣品濃度。

表1 RT-qPCR 引物序列

1.2.3 逆轉錄-定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）：將新鮮的子宮內膜組織用RNAlater處理。利用研磨棒將子宮內膜組織研磨至粉末狀，使用Trizol試劑裂解少量內膜組織，提取總RNA，并使用Nanodrop采用紫外分光光度計法測量其波長在260 nm和280 nm處的OD，并記錄RNA的純度和濃度。按照說明書中的逆轉錄反應體系配置：總體積為10 μL，其中，dNTP混合物0.4 μL、RNA酶抑制劑0.5 μL、10×RT Buffer 1 μL、隨機引物1 μL、蒸餾水和RNA的總體積為2.9 μL，使得RNA的總質量為500 ng，將所有混合物混合過程中均在冰盒上操作，混合后在逆轉錄儀器上進行逆轉錄。逆轉錄后進行RT-qPCR，PCR引物由吉凱基因公司合成。擴增條件：94 ℃ 預變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，變性、退火、延伸共循環40次。結束前72 ℃再延伸7 min，4 ℃保存。LC3、Beclin1 mRNA水平用GAP作為內參基因，基因的表達用△△Ct法定量分析，計算LC3、Beclin1 mRNA 表達水平。見表1。

1.3 統計學處理：統計學方法采用SPSS17.0統計軟件對研究數據進行分析，計量資料符合正態分布以“”表示，組間比較采用t檢驗，療效等級資料以率表示，采用秩和檢驗，以P＜0.05有統計學意義。

2 結 果

2.1 EMs和非EMs患者血清中LC3和Beclin1表達水平及比較：與非EMs組相比，EMs組的血清中LC3和Beclin1的表達顯著降低，且差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組患者血清中LC3和Beclin表達水平比較

表2 兩組患者血清中LC3和Beclin表達水平比較

組別 例數 LC3(μg/L) Beclin1(μg/L)EMs組 42 37.86±16.66 24.16±8.76非EMs組 42 76.34±16.19 56.45±16.44

2.2 EMs和非EMs患者腹腔液中LC3和Beclin1表達水平及比較：與非EMs組相比，EMs組的腹腔液中LC3和Beclin1的表達明顯下降，與血清中的趨勢一致，且差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 兩組患者腹腔液中LC3和Beclin1表達水平比較

表3 兩組患者腹腔液中LC3和Beclin1表達水平比較

組別 例數 LC3(μg/L) Beclin1(μg/L)EMs組 42 18.24±9.61 11.15±4.04非EMs組 42 38.07±10.86 21.32±5.06

2.3 EMs和非EMs患者子宮內膜組織中LC3和Beclin1表達水平及比較：與非EMs組相比，EMs組的子宮內膜組織中LC3和Beclin1 mRNA的表達顯著降低，與之前結果一致，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

3 討 論

EMs雖然屬于良性疾病，其生長模式和生物學特征卻與惡性腫瘤相似，曾有“女性盆腔沙塵暴”和“良性癌癥”之稱。其發病機制復雜，且尚不清楚，目前認為可能與遺傳物質、甾體激素類藥物、環境因素、免疫分子等多種生物活性因素相關。

圖1 在兩組患者的內膜組織中，檢測LC3、Beclin1 mRNA

近年來，人們對分子生物學的研究日益成熟，EMs與細胞因子之間的潛在關聯也越來越被關注和重視。自噬是指在真核細胞中，細胞利用溶酶體進行自我清除和降解自身受損的細胞器，在應激狀態下提供細胞所需的氨基酸和脂肪酸，從而維持細胞內環境的穩態。自噬是細胞為了使自身避免損傷、將有害物質清除以及修復基因突變所帶來的損傷，所做出的一種適應性反應[4]。自噬過程與多種自噬基因有關，其中，LC3和Beclin1是重要的自噬基因[5]。LC3屬于ATG8的同系物，存在于哺乳動物的體細胞中。由于LC3位于自噬體膜的表面，因此該基因被認為是自噬膜的標記，具有特異性，可作為膜受體參與多種細胞信號轉導[6]。后來LC3被認定為觀察自噬是否發生的一個標志性蛋白。Beclin-1，位于17q21上，有文獻報道，在卵巢癌和自發性乳腺癌細胞中發現有近一半的比率存在17q21染色體對偶基因缺失，還有研究者在小鼠實驗中，也發現在Beclin 1的對偶基因去除的實驗鼠中，其肝癌、淋巴癌及肺癌的發病率明顯高于對照組，可見，Beclin 1也是一種抑癌基因。

本實驗中，我們收集了84例患者的血清、腹腔液及子宮內膜組織，其中42例EMs患者，42例非EMs患者。在兩組患者的血清和腹腔液中分別檢測LC3和Beclin1的表達水平，結果顯示，與非EMs相比，EMs患者的血清和腹腔液中LC3和Beclin1的表達顯著降低；此外，我們利用RT-qPCR檢測了兩組患者的子宮內膜組織中LC3和Beclin1 mRNA的水平。結果表明，與非EMs相比，LC3和Beclin1 mRNA在EMs患者中呈現下調的趨勢，且具有統計學意義。以上表明，LC3和Beclin1在EMs患者中呈現低表達狀態。

綜上所述，LC3和Beclin1參與EMs發生發展，探究兩種基因與EMs發生的關聯，可為EMs的發病機制提供重要的理論依據，并為臨床提供治療EMs開拓新的思路和提供有效標志物。