DC-CIK細(xì)胞免疫療法在肝細(xì)胞癌治療中的應(yīng)用進(jìn)展

何英瓊(綜述)，蘇中振(審校) （中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院超聲科，廣東珠海）519000

提 要：肝癌是臨床上常見的惡性腫瘤，病死率高，大部分患者患病時已失去最佳手術(shù)治療時機(jī)。目前主要的保守治療方法有超聲引導(dǎo)下腫瘤射頻消融 、肝動脈栓塞療法、生物免疫治療以及分子靶向治療等。因肝癌是一種免疫相關(guān)疾病，為探索有效的細(xì)胞免疫治療方案，提高患者生存率及生活質(zhì)量，該文就樹突狀細(xì)胞-細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(DC-CIK)免疫療法在肝癌治療中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

肝癌是臨床常見的惡性腫瘤，尤其是原發(fā)性肝癌 (hepatocellularcarcino， HCC)預(yù)后差，多數(shù)患者被發(fā)現(xiàn)患病時已失去手術(shù)根治的機(jī)會，據(jù)統(tǒng)計只有9%～27%的患者具有手術(shù)機(jī)會[1]，故治療手段主要依賴保守治療如超聲引導(dǎo)下腫瘤射頻消融、肝動脈栓塞療法、生物免疫治療以及分子靶向治療等。因肝細(xì)胞癌也是一種免疫相關(guān)性的疾病，患者存在腫瘤免疫應(yīng)答及啟動免疫應(yīng)答方面的缺陷，故各種保守治療手段不僅不能有效清除腫瘤病灶，而且經(jīng)治療后患者自身的免疫功能下降，更容易導(dǎo)致殘留病灶復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。如何提高患者自身免疫能力抑制腫瘤復(fù)發(fā)成為治療中的難點。

1 樹突狀細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞

近年來，細(xì)胞生物免疫療法成為治療腫瘤的一種重要輔助手段。其中較為突出的是樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells， DC)以及細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(Cytokine-induced killercells， CIK)細(xì)胞， DC 和 CIK是人體攻擊腫瘤細(xì)胞重要的效應(yīng)細(xì)胞，經(jīng)過體外擴(kuò)增培養(yǎng)再會輸患者自身，這些特異性淋巴細(xì)胞通過黏附因子途徑與腫瘤細(xì)胞相結(jié)合，能穿透腫瘤細(xì)胞膜并裂解腫瘤細(xì)胞[2]。

1.1 DC的生物學(xué)特性及其抗瘤機(jī)制

DC是至今所發(fā)現(xiàn)的具備抗原遞呈功效最強(qiáng)的細(xì)胞，主要表現(xiàn)在能明顯引誘靜止 T淋巴細(xì)胞增殖和應(yīng)答，并促進(jìn)細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞生成方面。 CD34或CD14 細(xì) 胞是 DC的前體細(xì)胞，主要抗腫瘤機(jī)制有如下：(1)首先促使體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生大量效應(yīng) T細(xì)胞；(2)使活化的效應(yīng) T細(xì)胞遷移，并集中在腫瘤局部；(3)保持已經(jīng)趨化的效應(yīng) T細(xì)胞在腫瘤部位長期存在；(4)促進(jìn)體內(nèi)白細(xì)胞介素 (I n terleukin， IL )12、粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落刺激因子 IL -1、腫瘤壞死因子等細(xì)胞因子的分泌；(5)抑制腫瘤血管生成。

1.2 CIK細(xì)胞的生物學(xué)特性及抗瘤機(jī)制

1.2.1 CIK 生 物學(xué)特性 CIK 細(xì)胞是來自人體外周血單個核細(xì)胞 (來自自體或異體外周血、臍帶血或骨髓等)在體外經(jīng)各種細(xì)胞因子誘導(dǎo)后而培養(yǎng)的新型具備抗腫瘤免疫活性的細(xì)胞群，又稱為 N K細(xì)胞樣 T淋巴細(xì)胞，其中 CD3、 CD4、 C 8和 D 56細(xì)胞等異質(zhì)細(xì)胞群是主要的效應(yīng)細(xì)胞。 T淋巴細(xì)胞和 N K細(xì)胞在抗腫瘤方面的作用表現(xiàn)在能實行免疫監(jiān)視、殺傷腫瘤細(xì)胞及免疫調(diào)節(jié)等方面。因 T淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志CD3和NK 細(xì) 胞表面標(biāo)志 CD56 能 夠在CIK 細(xì)胞的細(xì)胞膜表面表達(dá)，故 CIK細(xì)胞同時具備 T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)以及 N K細(xì)胞介導(dǎo)的非主要組織相容性復(fù)合體來限制性來抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞。

1.2.2 CIK 細(xì) 胞治療肝癌的機(jī)制[3](1 )CIK 細(xì)胞促進(jìn)機(jī)體的 CD3、 CD4、 CD3/CD4 T淋巴細(xì)比例和CD56的升高，這些細(xì)胞毒性 T效應(yīng)細(xì)胞能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞；(2)促進(jìn)機(jī)體分泌大量細(xì)胞因子，如 IL -2、干擾素、腫瘤壞死因子等，從而為 CD3、CD4、 CD8、CD56等細(xì)胞產(chǎn)生同源二聚體蛋白，進(jìn)一步發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)；(3)促使腫瘤細(xì)胞的表面受體和效應(yīng)淋巴細(xì)胞的相關(guān)抗原結(jié)合，然后通過釋放顆粒酶/穿孔素等毒性顆粒起到直接殺傷靶細(xì)胞作用；(4)通過表達(dá)FasL(II型跨膜糖蛋白)， FasL 能夠與腫瘤細(xì)胞膜所表達(dá)的 Fas(I型跨膜糖蛋白)相結(jié)合，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡；(5)CIK細(xì)胞能降低肝細(xì)胞癌患者 AFP、ALT和AST水平，改善肝功能，提高患者生存質(zhì)量。

1.3 DC-CIK共培養(yǎng)抗瘤機(jī)制

DC的效應(yīng)是能夠識別病原從而激活機(jī)體獲得性免疫反應(yīng)， CIK效應(yīng)是針對病原時能夠發(fā)揮自身的細(xì)胞毒性作用和通過分泌細(xì)胞因子殺傷腫瘤細(xì)胞。DC與CIK各自的效應(yīng)能相互影響，經(jīng)共同培養(yǎng)后可以互相促進(jìn)彼此的成熟，主要機(jī)制是 DC所分泌的IL-2、 IL -12、IFN-7 等 因子能促使 CIK 的成熟，共培養(yǎng)后 CIK中的 CD3、 CD8、 CD56亞群含量有不同程度的升高。另外 ， DC-CIK共培養(yǎng)后， CIK中免疫抑制 T細(xì)胞亞群的含量明顯降低，從而實現(xiàn)進(jìn)一步增強(qiáng)CIK的殺瘤效應(yīng)， CIK還能提高 DC 和共刺激分子抗原遞呈的特異性作用。

2 目前采集單個核細(xì)胞的常用方法[4-5]

使用采血機(jī)采集患者外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，數(shù)量控制為(1 ～4)× 109個，總?cè)莘e為40～70 mL為宜。在符合要求的實驗室中，經(jīng) F icoll 淋巴分離液梯度離心，用 3次得到純凈的 PBMC，數(shù)量達(dá)(1 ～3)×107個。取得的 P MBC用 無血清培養(yǎng)液調(diào)至細(xì)胞密度達(dá) 2 ×106/mL后放置在細(xì)胞孵箱中孵育 2h， 待單核細(xì)胞貼壁，收集上層懸浮細(xì)胞用于制備CIK細(xì)胞，方法為使用無血清培養(yǎng)液調(diào)至細(xì)胞密度為(1～2)×106/ mL 時 ，在培養(yǎng)體系中加入 rhIFN-γ， 24h 后加CD3單克隆抗體、 rh IL-1a和rh IL-2，用來刺激CIK 的生長和增殖，每 3天換液并補(bǔ)加 rh IL-2，培養(yǎng)第 7天后即可收集 CIK。在剩余的附壁細(xì)胞中加入rh-GMCSF 和 rh IL-2的無血清培養(yǎng)液，置于細(xì)胞孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，從而誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化轉(zhuǎn)向 DC；每 3天換液并補(bǔ)充細(xì)胞因子，在培養(yǎng) 6d后，培養(yǎng)液中加入rh-TNF-a，進(jìn)一步誘導(dǎo)DC 成 熟；培養(yǎng)第7 天以后就可收獲成熟的 DC。收集以上所獲得的 DC和 CIK，按1:10比例共同培養(yǎng)，在無血清培養(yǎng)液中添加 rhIL-2，每隔 3天換液并補(bǔ)加 rh IL-2，培養(yǎng)第 7天就可收集DCCIK， 培養(yǎng)得到的細(xì)胞數(shù)量應(yīng)超過 1 ×1010個。 在整個培養(yǎng)過程中應(yīng)使用顯微鏡對 DC和 CIK情況進(jìn)行觀察，在收集共培養(yǎng)的細(xì)胞前應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌、真菌培養(yǎng)及內(nèi)毒素等檢測，確保共細(xì)胞成品的外源性因子，如細(xì)菌、真菌、內(nèi)毒素等均為陰性，細(xì)胞存活率超過 95%。除上述常規(guī)培養(yǎng)外，另有研究發(fā)現(xiàn)DCCIK 與 腫瘤射頻消融(Radiofrequency ablation, RFA)后的裂解物蛋白共同培養(yǎng)，形成的 Ag-DC-CIK細(xì)胞抗瘤活性更強(qiáng)[6]。 Shi等[7]在培養(yǎng) CIK時發(fā)現(xiàn)用羥乙基淀粉(HES)沉 降法收集的 CIK前 體(Pre-CIK)細(xì)胞比密度梯度離心法(Ficoll法)所收集的細(xì)胞免疫活性更強(qiáng)。如何使培養(yǎng)的 DC-CIK細(xì)胞抗腫瘤活性更強(qiáng)，維持時間更長久，也是研究的重點。

3 DC-CIK國內(nèi)外抗肝癌研究進(jìn)展

目前對 DC-CIK細(xì)胞治療的應(yīng)用主要在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、胃腸道腫瘤、胰腺癌和腎癌等方面，應(yīng)用在肝癌的治療上研究較少。有文獻(xiàn)表明，通過將體外培養(yǎng)的 DC-CIK細(xì)胞回輸患者本身能提高肝癌體內(nèi) T H1、 CD3、 CD4細(xì)胞因子水平，并促進(jìn)肝功能恢復(fù)[8]。 CIK細(xì)胞免疫療法不損害機(jī)體免疫系統(tǒng)，不僅能直接殺傷腫瘤細(xì)胞，還能同時清除殘留病灶，防止原發(fā)性肝癌的復(fù)發(fā)，并能改善患者的生活質(zhì)量[9]。經(jīng)體外人工培養(yǎng)的 CIK細(xì)胞還能分泌多種抑制腫瘤的細(xì)胞因子，通過有效調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，進(jìn)而間接殺傷腫瘤細(xì)胞；此外， CIK細(xì)胞還能激活腫瘤細(xì)胞的凋亡基因，進(jìn)一步促使腫瘤細(xì)胞凋亡[10]。

有研究表明[11]，早期肝癌患者經(jīng)過TACE+RFA+CIK 治 療，較未經(jīng) CIK 細(xì)胞免疫治療者總生存率更高，與外科手術(shù)治療后的總生存率相似[12]。賈詠存等[13]研究表明，DC-CIK細(xì)胞免疫治療可降低原發(fā)性肝癌患者外周血 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細(xì) 胞的百分?jǐn)?shù)，提高患者 T hl類細(xì)胞因子水平，是原發(fā)性肝癌的重要有效輔助手段。另有文獻(xiàn)報導(dǎo)肝癌患者經(jīng)過使用 DC-CIK細(xì)胞治療后，測得其外周血清甲胎蛋白(AFP)、 H ‐ 亞基鐵蛋白(HF)、癌胚抗原(CEA)、糖類抗原 199(CA199)水平較治療前降低[14]。 L ee等[15]對230位I/II期肝癌患者進(jìn)行了多中心、隨機(jī)試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接受了活化的 CIK免疫細(xì)胞治療的患者無復(fù)發(fā)和總生存率明顯優(yōu)于對照組。另外，研究還發(fā)現(xiàn)CIK細(xì)胞除了直接殺滅腫瘤作用外，還可能通過控制 H BV的復(fù)制間接降低腫瘤的復(fù)發(fā)。 L ee等[16]進(jìn)行的長達(dá) 5a的大樣本隨機(jī)試驗發(fā)現(xiàn)，使用 CIK 細(xì)胞治療的肝癌患者其生存期更長，復(fù)發(fā)及死亡風(fēng)險顯著降低； C hen等[17]針對 DC細(xì) 胞的治療也表明，接受DC細(xì)胞治療的肝癌患者不僅生存率提高，也無明顯副作用，安全性高。

DC-CIK細(xì)胞免疫治療在其他抗腫瘤方面，高會霞[18]在放化療聯(lián)合使用 DC-CIK細(xì)胞治療局部晚期的非小細(xì)胞肺癌患者臨床療效及生存期研究中發(fā)現(xiàn)，使用 DC-CIK細(xì)胞治療的患者臨床療效顯著提高，生存期明細(xì)延長。焦蘭等[19]在局部晚期乳腺癌患者研究發(fā)現(xiàn)化療聯(lián)合DC-CIK細(xì)胞治療后的患者外周血細(xì)胞CD3+CD8+、 CD3+CD56+的細(xì)胞比例明顯升高。與治療前比較，聯(lián)合治療組患者治療后 T細(xì)胞分泌IFN-y、IL-2水平顯著升高。劉慶等[20]在晚期結(jié)直腸癌患者的研究中也發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用 DC-CIK細(xì)胞聯(lián)合常規(guī)化療的患者外周血中 CD4+和 CD4+/ CD8+明顯提高，且患者體內(nèi) CD168、 CD133、 CD151等腫瘤促進(jìn)分子的含量與對照組患者相比明顯降低，而 CD9和 CD63等腫瘤抑制分子的含量明顯高于對照組患者，干擾素γ(I F N-γ)的含量也顯著升高；另外還發(fā)現(xiàn)未經(jīng)DCCIK細(xì)胞治療的患者單純接受化療后的 B 7-H4蛋白表達(dá)無明顯改變，而觀察組患者治療后的可溶性B7-H4 蛋 白表達(dá)明顯降低。因 B 7-H4與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、惡性表型以及腫瘤免疫密切相關(guān)[21]，高表達(dá)的B7-H4可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。這進(jìn)一步提示了DCCIK細(xì)胞治療后能夠通過減少B7-H4的蛋白表達(dá)來發(fā)揮調(diào)節(jié)患者免疫功能的作用。

由上可見， DC-CIK細(xì)胞不管在治療肝癌或者其他腫瘤的效應(yīng)機(jī)制有共通之處，都是通過刺激機(jī)體分泌更多的能抑制腫瘤效應(yīng)的細(xì)胞因子，下調(diào)促腫瘤因子，并通過調(diào)節(jié)腫瘤凋亡的相關(guān)信號分子及通路，但目前對此具體機(jī)制尚未完全清楚，相關(guān)研究猜測可能是該過程的發(fā)生可能與 B cl-2/Bax比例失調(diào)有關(guān)[22]。 Q ian等[23]研究發(fā)現(xiàn)，抑制該基因的表達(dá)，能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白 B ax表達(dá)，同時抑制抗凋亡蛋白 B cl-2的生成，通過調(diào)節(jié)兩者的蛋白表達(dá)含量及比例，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)，抑制該基因后，可使細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶 1 /2erk等的激活，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[24]。

另外，目前對肝癌的治療方法雖多，但病死率居高不下，侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肝癌腫瘤患者死亡的重要原因。近年來，上皮 – 間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用受到越來越多的關(guān)注，已有研究表明，肝癌的轉(zhuǎn)移、侵襲均與 EMT有關(guān)[25]。 EMT是 指上皮細(xì)胞受某些刺激因素失去上皮特性，細(xì)胞的極性、細(xì)胞間緊密連接和黏附連接減少甚至丟失，失去正常的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，變得孤立和易游走轉(zhuǎn)移，抗凋亡能力變強(qiáng)。 EMT也會促使一些參與細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜降解和破壞的溶解酶如基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)高表達(dá), 破壞組織學(xué)屏障, 便于細(xì)腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。 MMPs還與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)共同參與腫瘤血管形成，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤侵襲。EMT發(fā)生后，阻礙腫瘤細(xì)胞的早衰和凋亡，改變了腫瘤的微環(huán)境，使他們逃脫機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和清除。而 DC-CIK細(xì)胞免疫治療正是重新調(diào)節(jié)腫瘤的微環(huán)境，激活相關(guān)腫瘤殺傷因子，如白細(xì)胞介素(interleukin， IL )、粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落刺激因子、腫瘤壞死因子等，也可抑制腫瘤新生血管生成，通過各種機(jī)制抑制腫瘤 EMT化，從而降低肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，目前對 DC-CIK抑制肝癌細(xì)胞 EMT的信號通路尚不清楚。

4 DC-CIK治療安全性

DC-CIK細(xì)胞免疫治療屬于過繼性免疫治療，與其他同類過繼性免疫療法的細(xì)胞如嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，CRT-T)不同，其發(fā)生的脫靶效應(yīng)、細(xì)胞因子釋放綜合征和移植物抗宿主病樣損傷的不良反應(yīng)未見報道， DC-CIK臨床上主要以失眠、發(fā)熱、寒戰(zhàn)、興奮等為主，也未見明確器官損害的報道。有研究觀察 DC-CIK細(xì)胞治療Ⅲ期非小細(xì)胞肺癌的患者，在隨訪 36個月后，僅發(fā)現(xiàn)有 3名患者出現(xiàn)寒顫發(fā)熱[26]。在高會霞[18]的研究中同樣表明在聯(lián)合應(yīng)用DC-CIK細(xì)胞治療后，局部晚期的非小細(xì)胞肺癌患者出現(xiàn)惡心嘔吐、Ⅲ～ Ⅳ級骨髓抑制以及周圍神經(jīng)毒性等副作用的概率均相比單純同步放化療低，提示DC-CIK細(xì)胞治療可明顯改善患者的體力以及食欲；另外，有其他研究發(fā)現(xiàn)，長期進(jìn)行單純的化療會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，而 DC-CIK細(xì)胞的細(xì)胞免疫治療可通過攻擊腫瘤細(xì)胞表面過度表達(dá)的耐藥蛋白達(dá)到降低腫瘤耐藥性的作用 ，從而提高化療藥物殺傷作用[27]。

綜上所述 ，使用 DC-CIK細(xì)胞免疫療法可以短期內(nèi)提高肝癌患者的免疫力，調(diào)節(jié)患者血清腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物水平，改善肝功能情況；從遠(yuǎn)期看，減少或抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，這對患者的預(yù)后及生存質(zhì)量具有積極意義。另外， DC-CIK細(xì)胞免疫療法安全性高，為臨床治療肝癌提供新思路，值得進(jìn)一步深入研究后在臨床上應(yīng)用。