DNA甲基化與口腔疾病的研究進展

原振英 管翠強 南欣榮,

1.山西醫科大學口腔醫學院·口腔醫院 太原 030001；

2.山西醫科大學第一醫院口腔科 太原 030001

環境因素和遺傳多態性導致甲基化異常，異常的DNA甲基化水平與常見的口腔疾病相關，成為研究口腔疾病機制的熱點。

1 DNA甲基化與表觀遺傳學

表觀遺傳學是研究在基因的核苷酸序列不發生改變的情況下，基因表達的可遺傳性變化的遺傳學分支學科。表觀遺傳的現象很多，包括DNA甲基化（DNA methylation）、組蛋白修飾和非編碼RNA調節等[1]。表觀遺傳學調控機制對細胞分化至關重要，這一過程在每個特定生物體的細胞水平是高度保守的[2]。當這種高度保守的過程直接或間接地受到外部環境影響時，就會導致基因表達的改變，從而導致功能的改變[3]。例如，人類CD4+T細胞的分化受局部炎性物質的影響，這些炎癥物質或白細胞介素（interleukin，IL）進一步激活轉錄因子，這些轉錄因子與特定基因的啟動子區域中特定的甲基化或去甲基化位點結合，形成T細胞DNA，并決定T細胞發展譜系的命運。在特定基因啟動子區域附近DNA甲基化的增加導致T細胞表達減少，反之亦然[4]。同樣，在牙周炎等病理情況下，局部免疫反應由這些局部作用的轉錄因子和特定基因的甲基化或去甲基化決定[5]。

2 DNA甲基化與轉錄調節

DNA甲基化是一種DNA復制后的酶促反應過程[6]，是指生物體在DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase）的催化下，將S-腺苷甲硫氨酸分子上的甲基轉移到DNA分子中胞嘧啶的第5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶。隨著DNA分子引入甲基，DNA分子的構象改變，影響了DNA與蛋白質因子（如拓撲異構酶、RNA聚合酶、阻抑蛋白等）的結合[7]。哺乳動物基因組中5-甲基胞嘧啶的含量占總胞嘧啶的2%～7%，并集中在二核苷酸胞嘧啶（CpG）結構中[8]。

CpG位點以2種形式存在，一種是CpG結構在DNA中散在分布，每50～100 bp DNA中出現1個CpG，其中約70%的CpG位點中的胞嘧啶是甲基化的；另一種是CpG結構高度聚集在一起，即CpG島，僅占總DNA的1%～2%，長度為0.2～2 kb，位于基因的5’端啟動子區或延伸至第一外顯子區[9]。除X染色體基因、印跡基因之外，通常情況下CpG島不發生甲基化修飾。

CpG島甲基化與基因的表達密切相關[10]，可以抑制基因的表達，如在腫瘤發生機制中抑癌基因呈甲基化狀態[11]，導致抑癌基因失活。CpG島甲基化抑制基因表達的機制包括：1）CpG島甲基化改變了DNA分子構象，導致某些重要基團的隱蔽，直接干擾轉錄因子與調控區DNA結合。2）甲基化CpG與甲基化CpG結合區蛋白結合形成復合物，后者再募集組蛋白去乙酰酶形成復合物，結果使核心組蛋白尾區去乙酰化，形成更緊密的染色質結構，限制了轉錄因子到達其結合部位的通道，從而抑制基因轉錄[9]。在高等真核生物中，DNA甲基化可能參與基因的表達調控、發育調節、基因組印記和X染色體失活[12]。

3 DNA甲基化與口腔疾病

多種細菌和病毒可能導致口腔組織的DNA高度甲基化[13]。在口腔炎性疾病組織中，可以觀察到異常的DNA高度甲基化[14]。

3.1 DNA甲基化與慢性牙周炎

牙周病是一種由多種微生物感染引起的炎癥性疾病，其特點是牙周病原體與宿主免疫反應的相互作用。慢性牙周炎是最常見的一類牙周病[15]。

有研究[16]表明，表觀遺傳修飾在調節宿主免疫反應方面起著至關重要的作用，可能通過影響參與免疫反應的基因表達來促進疾病的發生和發展。由于局部免疫反應受到炎癥位點的表觀遺傳調控，所以在同一個體中炎癥位點與非炎癥位點的表觀基因組存在差異。與健康人的DNA甲基化特征相比，慢性牙周炎患者的DNA甲基化特征可能存在差異[13]。

表觀遺傳修飾不是永久性的，可以通過改變環境來逆轉[17]，因此通過牙周基礎治療（如刮治術）清除病原細菌可能會改變炎性區域的表觀基因組。Viana等[18]采用甲基化特異性聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）和DNA測序分析，分別對無牙周炎和慢性牙周炎患者的干擾素（interferon，IFN）-γ和IL-10的基因的DNA甲基化狀態進行檢驗，結果表明牙周組織編碼IFN-γ和IL-10的基因中存在甲基化。在類似的研究中，Stefani等[16]發現IL-6在慢性牙周炎患者牙齦組織中有較高表達水平，同時發現IL-6基因啟動子區域存在部分甲基化。Zhang等[19]也發現牙周炎患者牙周組織中IFN-γ基因啟動子區域內的低甲基化與IFN-γ基因轉錄表達的增加有關，并認為慢性牙周炎是一種不可逆轉的牙周病，DNA甲基化可能是控制腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α表達的重要調控機制。DNA甲基化調控在慢性牙周炎發病中的作用及其機制尚不明確，需要進一步研究來證實。

3.2 DNA甲基化與口腔癌

大部分口腔癌屬于發生于口腔黏膜的鱗狀細胞癌。在口腔癌的的發生、發展過程中，口腔黏膜經歷了異常增生、原位癌、浸潤癌的不同病理階段[20]。口腔癌高死亡率很大程度上歸因于后期診斷。對疾病尤其是惡性疾病早期發現，預后較好[21]。

早期研究[22]表明，口腔癌癌變早期及晚期均存在異常甲基化。在基因組的重復序列中，低度甲基化很常見，而高度甲基化則被認為是導致口腔癌發展的主要因素[23]。在致癌物中，煙草及其代謝產物在口腔癌的發展中存在80%以上的風險，并通過改變DNA甲基轉移酶的表達來促進基因的甲基化[24]。在癌變的早期階段，微小RNA（microRNA，miRNA）表達改變在細胞轉化過程中起關鍵作用[25]。

P16蛋白是抑制細胞周期G1期進展的調控因子，Cao等[26]通過甲基化特異性PCR技術檢測出，在93例入組患者中，32例（41.0%）在口腔上皮異常增生病變中存在p16甲基化；在隨訪的78例患者中，22例（28.2%）口腔上皮異常增生病變中存在癌變組織。使用p16甲基化預測口腔上皮異常增生惡變的敏感性和特異性分別為63.6%和67.9%。Liu等[27]發現以p16甲基化陽性標準作為早期預測癌癥發展的生物標志物時，靈敏度和特異性分別為62%和76%，進一步說明p16甲基化與口腔上皮異常增生的惡性轉化相關，是預測輕度或中度口腔上皮異常增生的潛在生物標志物。由于樣本含量以及研究設計的限制，仍需對口腔癌前期的表觀基因組甲基化研究進行大量的縱向追蹤。

近年來，對口腔鱗狀細胞癌的全基因組甲基化的研究集中在識別異常的DNA甲基化，這些研究表明甲基化可能是參與口腔鱗狀細胞癌發生、發展的重要機制，因此可以作為癌癥醫學診斷和預后的一個生物學標記物。然而，這些研究都是在特定地理位置的不同種族人群進行的，這些群體之間的表觀遺傳特征可能存在差異。因此，需要進行表觀遺傳學研究，以找出對口腔鱗狀細胞癌有意義的、獨特的DNA甲基化模式[22]。

3.3 DNA甲基化與口腔扁平苔蘚

口腔扁平苔蘚是一種常見的口腔黏膜慢性炎性疾病，病因和發病機制目前尚不明確[28]。

DNA甲基轉移酶包括3種類型：DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。DNMT3a與DNMT3b的功能是從頭合成甲基化，在控制基因活性、胚胎發育和基因組印記方面起著重要作用；DNMT1是一種維持性酶，主要是維持甲基化，確保每個細胞的DNA甲基化模式正常復制，因此DNA甲基轉移酶建立了一種新的甲基化模式[14]。

研究[29]表明，在口腔扁平苔蘚中觀察到DNA甲基轉移酶（包括DNMT3b和DNMT1）的表達增加，DNMT3b的表達增加是由于DNA多態性。口腔扁平苔蘚與正常黏膜相比，miR-137啟動子區域呈現高度甲基化特征[25]。Cruz等[30]采用橫斷面研究方法分析了口腔扁平苔蘚非糜爛病變組、糜爛病變組以及正常口腔黏膜（對照組）不同類型的DNA甲基化模式，結果發現僅在對照組（59.0%）中觀察到STAT5A（信號傳導及轉錄激活因子）基因的高度甲基化，與正常口腔黏膜相比，免疫應答相關基因的甲基化情況有所不同，需要進一步使用基因表達分析的研究來驗證這些發現。

4 DNA甲基化與復發性阿弗他潰瘍研究展望

復發性阿弗他潰瘍是最常見的口腔黏膜潰瘍類疾病，調查發現至少10%～25%的人群患有這種疾病[31]。這種疾病具有周期性、復發性、自限性特征；潰瘍灼痛明顯；好發于唇、頰、舌、軟腭等無角化或角化較差的黏膜；根據臨床表現可將其分為輕型、皰疹型（滿天星樣）、重型（彈坑樣）；典型病灶具有“黃、紅、凹、痛”的特征表象，即潰瘍表面覆蓋黃色假膜，周圍有紅暈帶，中央凹陷，疼痛明顯。輕者數月發作1次，重者慢性遷延，反復發作，妨礙飲食或說話，患者十分痛苦[32]。

復發性阿弗他潰瘍的病因復雜，發病因素甚多，且尚未統一。但已有研究[33-34]證實，復發性阿弗他潰瘍的發生與細胞免疫功能下降及T淋巴細胞亞群失調有關，其中輔助性T（T helper，Th）細胞起著重要的作用。Th1細胞主要產生IL-2和IFN-γ，參與調控細胞免疫；Th2細胞分泌IL-4、IL-5、IL-10等，具有體液免疫的輔助功能[35]。Lewkowicz等[36]發現，在復發性阿弗他潰瘍患者的細胞中存在一種典型的Th1型基因，Th1相關基因出現高水平表達；發現Th2細胞出現趨化因子C-C基序受體3的高水平表達。這些發現表明復發性阿弗他潰瘍形成主要依賴于Th1型免疫反應的激活，患者Th1/Th2免疫失衡。

Bird等[37]的研究證實，在細胞因子以及轉錄因子調控Th1及Th2細胞分化的同時，伴隨著DNA甲基化表觀遺傳的修飾，協同調控Th1及Th2細胞分化。有學者[38]指出，分化后的Th2細胞分泌的IL-4伴隨著IL-4基因CpG島的去甲基化；同時Th1細胞TNFG表達的增加伴隨著IFN-γ基因的低度甲基化狀態。

研究[13]已經證實，表觀遺傳調控與多基因復雜性狀疾病的發病密切相關。復發性阿弗他潰瘍的發生較為常見，是多基因綜合作用的結果，且病情嚴重程度存在明顯的個體差異。前面提到的炎癥介質重要基因包括IL-4、TNFG等，其序列的變異可能會改變機體Th1/Th2細胞平衡以及炎癥介質的調控，從而對復發性阿弗他潰瘍的易感癥和嚴重程度產生影響。因此，在DNA甲基化水平研究復發性阿弗他潰瘍的發病機制，進一步用于疾病的預防及治療具有非常重要的意義。

5 結語

綜上，個體基因序列的差異可以影響個體對炎癥的反應，而DNA甲基化的改變可以調控這種基因的表達，從而動態地調節個體對炎癥的反應。在口腔疾病中，表觀遺傳修飾作用的證據正在增加。許多環境因素影響口腔組織的變化，但就其對退行性和炎癥性疾病的影響方面的研究知之甚少。表觀遺傳修飾是可逆的，因此它可以作為治療靶點。表觀遺傳治療可應用于復雜性口腔炎癥類疾病（如復發性口腔潰瘍和口腔扁平苔蘚），但在對口腔疾病的表觀遺傳治療領域取得進展之前，還需要進一步的研究。