持續(xù)性根尖周炎根管內(nèi)外生物膜特性的研究進(jìn)展

楊子 侯本祥

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院牙體牙髓病科 北京 100050

持續(xù)性根尖周炎（persistent apical periodontitis，PAP）又稱(chēng)為難治性根尖周炎（refractory apical periodontitis），是指通過(guò)反復(fù)的根管治療，竇道仍不愈或根尖周病變持續(xù)存在的慢性根尖周炎[1]。

研究[2]表明，PAP與根管內(nèi)外存在的微生物的定植和感染有關(guān)。根外生物膜附著于根尖區(qū)牙骨質(zhì)或超填的牙膠尖表面，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其來(lái)源于根管內(nèi)生物膜，但其是否仍依賴(lài)于根內(nèi)感染存在目前仍不確定，本文從PAP與生物膜的關(guān)系、根管內(nèi)外生物膜細(xì)菌組成的異同及其依存關(guān)系等方面對(duì)PAP的病因進(jìn)行進(jìn)一步探討。

1 PAP與生物膜的關(guān)系

形態(tài)學(xué)及組織學(xué)研究顯示，PAP根管內(nèi)外均存在細(xì)菌生物膜，但根管內(nèi)外細(xì)菌生物膜組成有所不同，根管內(nèi)生物膜以絲狀和分支狀細(xì)菌為主導(dǎo)。

Nair等[3]通過(guò)光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡對(duì)6例PAP患牙根尖進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)根管內(nèi)有生物膜覆蓋，其內(nèi)有大量的革蘭陽(yáng)性的絲狀及分支狀細(xì)菌。Carr等[4]通過(guò)根尖手術(shù)獲取非手術(shù)再治療失敗患牙根尖組織，透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)根管內(nèi)大量生物膜結(jié)構(gòu)，幾乎所有的細(xì)菌都被包裹在由不同變性階段的細(xì)菌組成的多層的厚的細(xì)胞外基質(zhì)中，其中可見(jiàn)凋亡細(xì)胞、影細(xì)胞以及分裂細(xì)胞。

根外生物膜既可由單一菌種構(gòu)成，也可由多菌種共同組成，以球菌、桿菌和絲狀菌為主，也可見(jiàn)到螺旋體及真菌存在。Wang等[5]和Sousa等[6]分別對(duì)35例及20例PAP患牙根尖外表面進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察，均檢出根外生物膜的存在，其內(nèi)含有大量棒狀菌和絲狀菌。

Su等[7]在掃描電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，PAP患牙接近根尖孔牙根表面緊密堆積有微生物和細(xì)胞外基質(zhì)，在纖維束和細(xì)胞之間的不規(guī)則表面以及隱窩和孔中可觀察到細(xì)菌斑塊，細(xì)菌形態(tài)類(lèi)型以球菌和桿菌為主。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)PAP患牙菌根尖外表面均有生物膜，具有球狀、絲狀、芽胞桿菌、桿菌的形態(tài)學(xué)多樣性。Ferreria等[9]在難治性根尖周炎患牙根尖生物膜中觀察到真菌的存在。

2 根管內(nèi)外生物膜細(xì)菌構(gòu)成的區(qū)別

微生物群落分析通常采用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)的方法，但影響培養(yǎng)的因素很多，隨著分子生物學(xué)方法的進(jìn)步，例如，擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物的指紋圖譜、棋盤(pán)雜交、定量PCR等方法廣泛應(yīng)用，可以檢出更多無(wú)法培養(yǎng)的微生物。

如今高通量方法也逐步開(kāi)始應(yīng)用于口腔內(nèi)微生物的檢測(cè)，包括微陣列、下一代測(cè)序技術(shù)、宏基因組學(xué)等方法。

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)出的細(xì)菌種類(lèi)

使用傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法通常會(huì)遺漏難以培養(yǎng)的細(xì)菌，從而低估與持續(xù)性疾病相關(guān)細(xì)菌群落的多樣性。大量研究采用細(xì)菌培養(yǎng)的方法顯示，PAP根管內(nèi)生物膜僅能檢測(cè)到一種或幾種菌種，由厭氧菌主導(dǎo)，革蘭陽(yáng)性菌比例較高，其中糞腸球菌最常見(jiàn)。

?ysakowska等[10]對(duì)28例持續(xù)性根尖周病變的患牙進(jìn)行再治療，在根管內(nèi)檢測(cè)出微生物以鏈球菌、腸球菌、丙酸桿菌屬、放線菌屬及乳桿菌屬為主。

根外細(xì)菌生物膜采用傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法可見(jiàn)多種細(xì)菌混合感染，以厭氧菌為主導(dǎo)。Tronstad等[11]對(duì)8個(gè)無(wú)癥狀PAP患牙的根尖周軟組織病變和根尖表面微生物進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)分離培養(yǎng)的細(xì)菌以厭氧菌為主，包括產(chǎn)黑色素?cái)M桿菌、表皮葡萄球菌、放線菌屬、兼性鏈球菌屬及革蘭陽(yáng)性厭氧桿菌和球菌等。

2.2 非培養(yǎng)方法

近年來(lái)，用分子生物學(xué)方法檢測(cè)微生物的多樣性，對(duì)尚不能進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)鑒定，根內(nèi)、外生物膜的細(xì)菌組成發(fā)現(xiàn)，根管內(nèi)生物膜腸球菌、鏈球菌及梭桿菌檢出率較高，其中糞腸球菌最為常見(jiàn)[1]，并檢測(cè)出許多難以培養(yǎng)的細(xì)菌，例如D. invisus[12-13]、Synergistes clone BA121[14-15]等，具體見(jiàn)表1。

根外生物膜以放線菌屬、丙酸桿菌屬、梭桿菌檢出率較高，具體見(jiàn)表2。

表1 PAP根管生物膜優(yōu)勢(shì)菌檢出各研究比較Tab 1 Bacterial respective genera and species commonly found in the root canal associated with PAP

續(xù)表1

表2 PAP根尖生物膜優(yōu)勢(shì)菌的檢出比較Tab 2 Bacterial respective genera and species commonly found in extraradicular biofilm associated with PAP

2.3 高通量方法

非培養(yǎng)方法通過(guò)分析單一的病原體及病原體的分布及其與根尖周疾病之間的關(guān)系，從而提高對(duì)PAP根尖微生物群的了解。采用高通量的方法對(duì)根管內(nèi)生物膜進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)和梭桿菌門(mén)的檢出率較高，但對(duì)根外生物膜采用高通量方法進(jìn)行群落分析的研究較少。Siqueira等[23]對(duì)10例PAP患牙的根尖進(jìn)行冷凍研磨提取根管系統(tǒng)內(nèi)微生物，采用Illumina測(cè)序方法進(jìn)行群落分析，發(fā)現(xiàn)超過(guò)85%的序列屬于變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、梭桿菌門(mén)和放線菌門(mén)，其中變形菌門(mén)的檢出率最高。Ping等[24]通過(guò)根尖手術(shù)收集了20例PAP患牙的根尖部分，將根尖樣品進(jìn)行低溫研磨進(jìn)行454-焦磷酸測(cè)序分析，其中厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、梭桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、互養(yǎng)菌門(mén)和螺旋體門(mén)均為最具代表性的門(mén)。Hong等[25]及Keskin等[26]通過(guò)高通量焦磷酸測(cè)序的方法發(fā)現(xiàn)持續(xù)性感染的根管內(nèi)與初次感染的根管內(nèi)細(xì)菌種類(lèi)無(wú)明顯差異，但Tzanetakis等[27]的研究認(rèn)為相比于初次感染，持續(xù)性感染根管內(nèi)變形菌門(mén)及柔膜菌門(mén)顯著增多。

目前提出許多可以提供關(guān)于群落生理和功能的寶貴信息的方法，例如宏基因組學(xué)（直接從環(huán)境/中獲得的DNA的全基因組分析），轉(zhuǎn)錄組學(xué)（RNA表達(dá)分析），蛋白質(zhì)組學(xué)（大規(guī)模蛋白質(zhì)表達(dá)分析）和代謝組學(xué)（代謝物剖面分析），已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用于牙髓病學(xué)研究，Provenzano等[28]對(duì)10例PAP患牙行根尖手術(shù)，根尖周肉芽組織及根尖冷凍研磨后均進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)一些與致病性相關(guān)的蛋白質(zhì)，包括與抗藥性，蛋白水解功能，黏附和毒力相關(guān)的蛋白質(zhì)，且與腸球菌種、放線菌種、痤瘡丙酸桿菌、鏈球菌、普雷沃氏菌等細(xì)菌有關(guān)。這些方法有可能公開(kāi)與臨床癥狀相關(guān)的分子模式，從而可能起到預(yù)測(cè)結(jié)果的作用。

3 根管內(nèi)生物膜與根外生物膜的依存關(guān)系

大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為根外生物膜來(lái)源于根管內(nèi)生物膜，根管內(nèi)細(xì)菌可能通過(guò)根尖孔、側(cè)支根管或通過(guò)根表面牙骨質(zhì)被吸收的區(qū)域中的牙本質(zhì)小管到達(dá)根尖周組織，從而形成根外表面生物膜。其次在根管治療過(guò)程中，根管內(nèi)細(xì)菌也可能被推入根尖周?chē)M織。

此外，Kishen[29]通過(guò)對(duì)根尖部液體運(yùn)動(dòng)分析測(cè)量證明，咬合可能導(dǎo)致細(xì)菌從根管內(nèi)轉(zhuǎn)移到根尖周組織。但根外生物膜是否依賴(lài)于根內(nèi)生物膜存在至今仍存疑，已有大量研究對(duì)不同牙齒的根管內(nèi)外的細(xì)菌組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其檢出種類(lèi)及檢出率等均有所區(qū)別，但對(duì)同一患牙根管內(nèi)外生物膜的比較研究較少。

3.1 同一患牙根管內(nèi)外生物膜形態(tài)學(xué)分析

Tronstad等[30]對(duì)PAP患牙的根尖進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)根尖外表面處的細(xì)菌嵌入根尖孔外無(wú)結(jié)構(gòu)組織中，推測(cè)其來(lái)源于根管；根尖側(cè)方的細(xì)菌生物膜通常在軟組織覆蓋的隱窩或孔的內(nèi)部或周?chē)嬖冢g接表明這些區(qū)域的微生物也可能來(lái)自根管內(nèi)。一些研究[31-33]通過(guò)對(duì)PAP患牙根尖部進(jìn)行組織學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)根外生物膜與根管生物膜相鄰，支持根外生物膜是根管生物膜的延伸這一假設(shè)。但也有1例病例報(bào)道[31]對(duì)持續(xù)性低密度影的患牙進(jìn)行根尖手術(shù)，病理報(bào)道為根尖周囊腫，囊內(nèi)可檢測(cè)出放線菌，但根管系統(tǒng)內(nèi)無(wú)明顯感染，此病例提示在某些特殊情況在獨(dú)立于根管內(nèi)感染的根外感染可能是引起持續(xù)性病變的原因。

3.2 同一患牙根管內(nèi)外細(xì)菌構(gòu)成的異同

對(duì)同一患牙的根管內(nèi)外樣本進(jìn)行取樣進(jìn)行細(xì)菌群落分析的研究較少，Noguchi等[21]對(duì)PAP患牙研究發(fā)現(xiàn)，根外生物膜內(nèi)檢測(cè)到的細(xì)菌從同一牙齒的根管中的檢出率為86.7%，從而認(rèn)為殘留在根管中或從瘺管侵入的細(xì)菌可能成為根外生物膜的主要來(lái)源。Kuremoto等[34]采用單純髓腔開(kāi)放法建立大鼠根外生物膜模型，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR對(duì)根管內(nèi)外生物膜進(jìn)行分析，在根管及根尖外表面檢測(cè)出了相似的細(xì)菌物種，認(rèn)為根管內(nèi)細(xì)菌進(jìn)一步發(fā)展形成根外生物膜，根管內(nèi)生物膜的殘留細(xì)菌增加根外生物膜形成的可能。

4 PAP感染控制的方法

根管治療及再治療后仍然不成功是根尖手術(shù)的適應(yīng)證，通過(guò)切除患牙根尖1/3、倒預(yù)備及倒充填的方法去除根尖部的感染[35]，研究[36]發(fā)現(xiàn)PAP患牙采用根尖手術(shù)的方法具有良好的長(zhǎng)期預(yù)后。Wang等[37]對(duì)81名患者進(jìn)行前瞻性隊(duì)列研究，顯微根尖手術(shù)后12～30月進(jìn)行復(fù)查，愈合率達(dá)到90.5%。根管再治療配合根尖手術(shù)是目前最值得推薦的方法。