膽道微生態(tài)與膽總管結(jié)石形成關系的研究進展

安愛虎，周文策，張輝

（1.蘭州大學 第一臨床醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730099；2.蘭州大學第一醫(yī)院 普外二科，甘肅 蘭州 730099）

膽石癥是全世界的主要公共衛(wèi)生問題之一，是常見病和多發(fā)病[1-3]。在西方國家，膽石病患病率男性為7.9%，女性為16.6%，但很少報道有膽總管結(jié)石[4]。相比之下，我國膽石病檢出率為4.2%～12.1%[5]，其中膽總管結(jié)石約占10%～20%[3，5]。膽總管結(jié)石屬于膽石病范疇，依據(jù)結(jié)石來源可分為原發(fā)性膽總管結(jié)石和繼發(fā)性膽總管結(jié)石。原發(fā)性膽總管結(jié)石初始于膽總管，絕大多數(shù)為棕色色素結(jié)石；而繼發(fā)性膽總管結(jié)石是指原發(fā)于膽囊，經(jīng)膽囊管遷移至膽總管的結(jié)石，多為膽固醇類或黑色素結(jié)石[6-7]。值得注意的是，兩類膽總管結(jié)石的發(fā)病機制不同，故本文中若無特殊說明，“膽總管結(jié)石”皆指原發(fā)性膽總管結(jié)石。

膽總管結(jié)石在我國是一種常見且危害嚴重的疾病，由于其殘石率、復發(fā)率及再手術率高，使其臨床療效尚不令人滿意。因此，研究其病因及發(fā)病機制對于有效預防和治療本病具有重要意義。近年來分子生物學技術的發(fā)展和應用，為膽道微生物群落與膽總管結(jié)石形成關系的研究提供了一個新的契機，使得結(jié)石形成機制的研究進入了新階段。本文將針對膽道微生態(tài)與膽總管結(jié)石形成關系的研究進展進行綜述。

1 膽道微生態(tài)與膽總管結(jié)石的關系研究

膽總管結(jié)石發(fā)病機制復雜，目前尚未完全清楚。隨著研究的不斷深入，許多證據(jù)表明膽道微生態(tài)與膽總管結(jié)石的形成密切相關[8]。

早在20世紀初期就有學者發(fā)現(xiàn)膽石病患者的膽汁中有病原菌存在，并鑒定出了大腸埃希菌、鏈球菌及葡萄球菌等多種細菌，推測膽道細菌感染可能是結(jié)石形成的重要原因之一[9]。直到1966年，日本學者Maki[10]提出了經(jīng)典的膽紅素鈣結(jié)石成因假說：感染膽汁中的細菌，尤其是大腸埃希菌，可產(chǎn)生大量外源性β-葡萄糖醛酸苷酶（β-G），將水溶性的結(jié)合膽紅素水解為不溶于水的游離膽紅素和葡萄糖醛酸，前者再與膽汁中的鈣離子結(jié)合形成膽紅素鈣沉淀析出。Higashijima等[11]和Leung等[12]采用體外實驗的方法證實了這一結(jié)論。我國學者蔡紅嬌等[13]對膽紅素鈣結(jié)石的形成機制做了進一步的探索，發(fā)現(xiàn)膽道細菌感染對肝臟的損害以及細菌酶的作用，改變了膽汁的理化性質(zhì)，破壞了膽汁膠體的平衡狀態(tài)，形成成石膽汁，其中去氧膽酸等疏水性物質(zhì)在酸性促發(fā)物的作用下凝集成核，進而促進結(jié)石形成。

為了進一步研究細菌在結(jié)石形成過程中的作用，Stewart等[14]應用掃描電子顯微鏡（SEM）對棕色色素結(jié)石進行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是新鮮結(jié)石，還是風干結(jié)石，其核心和外周各層均有細菌存在。深入的分析表明不僅細菌的某些代謝產(chǎn)物參與結(jié)石的形成，細菌體本身也是結(jié)石重要的構(gòu)成成分[14-15]。Leung等[16]采用同樣的方法證實了這一研究成果，此外，還用透射電子顯微鏡（TEM）觀察到細菌被釕紅染色的膜狀物質(zhì)所覆蓋，推測其可能是細菌生物膜。這種由多糖、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等物質(zhì)組成的生物膜充當了細菌的保護層，允許其在膽道惡劣的環(huán)境中生存、繁殖[17]。電鏡在膽道微生態(tài)研究方面的應用能夠敏感地發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)陰性的細菌，再次證實了細菌參與棕色色素結(jié)石的成核及生長，然而卻無法明確其作用機制。

隨著分子生物學技術的發(fā)展和應用，非培養(yǎng)依賴的微生物鑒別方法逐漸應用到膽道微生態(tài)研究領域。1995年，Swidsinski等[18]首次運用PCR技術和16S rRNA序列分析法在膽結(jié)石中發(fā)現(xiàn)了細菌DNA，并得到Kawai等[19]的進一步證實。劉敏等[20]運用PCR-DGGE技術對棕色色素結(jié)石患者的膽汁和結(jié)石標本進行分析，鑒定出了包括埃希氏菌屬在內(nèi)的9個屬的細菌，其中，大腸埃希菌在兩種標本中的檢出率都是最高的；此外，在膽汁與結(jié)石的DGGE指紋圖譜相似性分析中，菌落結(jié)構(gòu)的最高相似性系數(shù)僅為32.3%，這說明膽汁和結(jié)石中的細菌群落并不完全相同。

近年來，基于下一代高通量測序技術的宏基因組學逐漸應用到人類微生物組的研究，使人們對人體微生態(tài)有了更加全面、深入的認識[21]。吳韜等[22]首次采用16S rRNA擴增子測序（簡稱16S測序）技術對膽囊結(jié)石患者進行研究，結(jié)果顯示細菌DNA檢出率為100%，并鑒定出膽道核心細菌106種，然而僅有33.96%能匹配到已知的菌種；此外，還發(fā)現(xiàn)膽囊結(jié)石患者存在明顯的腸道菌群失調(diào)。Shen等[23]對膽總管結(jié)石患者的膽總管膽汁樣本進行全宏基因組鳥槍法（whole-metagenome shotgun，簡稱WMS）測序和16S測序分析，共鑒定出了173種菌種，主要類聚為兩大類，其一以來自腸道、口腔和呼吸道的細菌為主，其二以來自口腔和呼吸道的細菌為主。然而，來自口腔和呼吸道的細菌要比腸道細菌更為普遍，因此，除了腸道細菌之外，口腔和呼吸道細菌也可能是膽道細菌的重要來源。同時，基于WMS測序該研究還鑒定出了可能與結(jié)石形成和膽汁耐受有關的細菌基因，如uidA基因（編碼β-G）和pldA基因（編碼磷脂酶A1）。為了進一步探索膽道細菌來源，該研究團隊接著對膽總管膽汁、十二指腸液、胃液和唾液標本進行16S測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膽道菌群與十二指腸菌群更為相似，這在一定程度上說明膽道細菌可能來源于腸道細菌的逆行感染[24]，與梁廷波等[25]的研究結(jié)果一致。基于之前的研究成果，Kose等[26]通過WMS測序還發(fā)現(xiàn)了與膽汁應激反應和生物膜形成相關的細菌功能基因。

2 膽道細菌的來源

傳統(tǒng)觀點認為，在正常情況下膽道系統(tǒng)是一個無菌的環(huán)境[27]。然而，法醫(yī)學尸檢研究發(fā)現(xiàn)，無膽道疾病的病例其膽道中也有細菌存在[28]。這一發(fā)現(xiàn)引起了人們探索膽道微環(huán)境的興趣：膽道中是否也像腸道一樣存在一個微生態(tài)系統(tǒng)？需要注意的是，膽總管膽汁取樣困難，且為有創(chuàng)操作，由于倫理問題不能取得無膽道疾病人群的膽汁樣本，使得研究進展非常緩慢。為此，Jiménez等[29]對健康豬的膽道系統(tǒng)進行了研究，令人意外的是，其膽道中均發(fā)現(xiàn)有細菌存在。這一發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)觀點相反，使人們對膽道微環(huán)境又有了一個新的認識。有研究報道，人體微生物組的某個微生態(tài)并不是孤立的，而是相互影響、緊密聯(lián)系的一個整體[30]。因此，有理由認為人體膽道與腸道微生態(tài)之間也有關聯(lián)。筆者提出這樣一個假設：膽道系統(tǒng)中存在一個特殊的微生態(tài)系統(tǒng)，這個微生態(tài)受到某些因素的干擾而失衡，而這種失衡過程可能與膽道疾病的發(fā)生有關。盡管已有很多研究表明細菌可能通過腸膽反流、門靜脈系統(tǒng)、膽管周圍淋巴系統(tǒng)或多種途徑并存而進入膽道[23-25，31]，但至今仍無定論，尚需進一步研究。

3 膽總管結(jié)石形成的細菌學機制

3.1 β-葡萄糖醛酸苷酶

如前文所述，自從經(jīng)典的Maki假說[10]描述了細菌在膽紅素鈣結(jié)石發(fā)生機制中的作用之后的很長一段時間內(nèi)，細菌源性的β-G一直被認為是棕色色素結(jié)石形成的重要原因[12，32]。在以犬為模型的動物實驗中，同樣證實了這一結(jié)論[33]。研究者通過結(jié)扎以縮小膽囊管，觀察到膽囊中有棕色色素結(jié)石形成，進一步分析發(fā)現(xiàn)膽囊、膽汁以及肝臟中都有能產(chǎn)生β-G的細菌存在；另外，將大腸埃希菌注入動物模型的脾臟，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脾臟中也有結(jié)石形成。

3.2 磷脂酶

有研究報道，棕色色素結(jié)石中所含的棕櫚酸鈣（約占結(jié)石干重的15%）與膽道感染細菌所產(chǎn)生的磷脂酶有關[34]。感染膽汁中的磷脂酶水解磷脂生成的棕櫚酸與膽汁中的鈣離子結(jié)合形成不溶于水的棕櫚酸鈣沉淀，參與棕色色素結(jié)石的形成[35]。Stewart等[32]的研究發(fā)現(xiàn)感染膽汁中游離脂肪酸濃度和磷脂酶活性均顯著增高。Shen等[23]采用WMS測序技術在膽總管結(jié)石患者感染的多種細菌中鑒定出了pldA基因，再次從基因水平證明細菌源性磷脂酶參與棕色色素結(jié)石的形成。

3.3 黏液和黏蛋白

Maki[10]在研究中發(fā)現(xiàn)，向膽紅素鈣沉淀中加入海藻酸鈉可使其凝聚而形成結(jié)石。海藻酸鈉的化學性質(zhì)與細菌黏液相似，而黏液的主要成分是黏蛋白，其化學本質(zhì)是高分子量陰離子糖蛋白，相互凝集構(gòu)成的網(wǎng)狀支架可將膽汁中的膽紅素鈣、棕櫚酸鈣沉淀甚至細菌微菌落聚集在一起而形成結(jié)石[32，36-37]。Stewart等[36]研究發(fā)現(xiàn)，62%的棕色色素結(jié)石患者膽道內(nèi)能檢測到細菌源性β-G，但對于細菌黏液而言，這個數(shù)字為100%，這表明細菌產(chǎn)生的黏液可能比β-G在結(jié)石的形成中具有更重要的作用。

3.4 細菌的自我保護機制

膽道環(huán)境中的各種極端因素，如膽汁酸、營養(yǎng)限制、pH及滲透壓的變化等構(gòu)成了細菌生長、繁殖的潛在障礙。然而，有些種類的細菌，例如大腸埃希菌、克雷伯氏菌、腸球菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌等為了能在膽道系統(tǒng)中存活，在膽汁酸的作下可迅速形成細胞壁缺陷型變體，即L型細菌[38-39]。由于L型細菌致病力不強，抗原性減弱，可逃避機體免疫系統(tǒng)的攻擊，同時又因其對細菌細胞壁特異性抗生素的敏感性不同于細菌型[39-40]，故可在膽道系統(tǒng)內(nèi)長期留存，成為膽道感染的“潛在菌群”，使膽道持續(xù)處于慢性炎癥狀態(tài)而有利于結(jié)石形成。

除了細菌L型之外，生物膜的形成也是細菌自我保護的一種極其重要的方式，同時在膽道的慢性感染中也有著重要的意義[17]。細菌生物膜的特征在于粘附于介質(zhì)表面并形成保護性細胞外基質(zhì)以及包裹于其中的微生物群落，其中，基質(zhì)約占生物膜干重的90%，通常是由細胞外聚合物，如黏液、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖和核酸等組成的復雜的聚集體[41]。與浮游生活方式不同的是，嵌入生物膜內(nèi)的細菌對宿主的免疫清除、抗生素以及機械應力都具有高度抗性[17，42]。正因為如此，固定于生物膜中的細菌才具有很高的存活率和持久的潛在的感染力，并在小鼠動物實驗中得到了證實[43]。

3.5 腸道菌群

人類腸道內(nèi)生活著數(shù)目龐大、結(jié)構(gòu)復雜的微生物群落，因其與人體健康和疾病有著密切的關系，故有學者稱其為“被遺忘的器官”[44]。腸道微生態(tài)與宿主一同進化，并參與機體代謝、營養(yǎng)及免疫等諸多生理活動[45-46]。正常情況下，腸黏膜屏障可保護機體免遭腸道細菌侵害，然而，當其功能異常或腸道菌群失調(diào)時，可引起腸道細菌易位、內(nèi)毒素血癥、炎性介質(zhì)釋放和激活等病理生理過程，從而引起各種疾病的發(fā)生[47]。于浩等[48]在以豚鼠為動物模型的研究中發(fā)現(xiàn)，破壞其腸黏膜屏障，膽色素結(jié)石的發(fā)病率明顯增高，而與之相比，給予谷氨酰胺改善腸黏膜屏障功能可降低結(jié)石形成率。

既往研究發(fā)現(xiàn)，腸膽反流是導致膽道感染的主要原因之一[25]。膽總管末端的Oddi括約肌是控制膽汁排放和防止腸內(nèi)容物反流的唯一門戶，其功能狀態(tài)與膽總管結(jié)石的形成密切相關。Oddi括約肌松弛或關閉不全等功能異常時，腸內(nèi)容物很容易反流進入膽道，致使膽道微環(huán)境污染，甚至是膽道感染，進而促使結(jié)石形成[49]。

3.6 細菌引起膽總管結(jié)石形成的其他機制

膽道慢性炎癥是膽總管結(jié)石形成的潛在危險因素[43]。如前文3.4所述，細菌的多種自我保護機制使得其能夠在膽道系統(tǒng)中長期定植而引起膽道慢性炎癥。慢性細菌感染可持續(xù)激活膽管上皮細胞的免疫應答反應，分泌大量的炎性細胞因子，如IL-6、IL-10、IL-12（p70）和IL-13等[50]，以及免疫球蛋白，如sIgA、IgM和IgG等[51]，這些物質(zhì)可以促使細菌聚集而參與結(jié)石的形成。此外，持續(xù)的局部炎癥也會引起膽管上皮損傷，造成膽管壁水腫、增厚，甚至膽管狹窄，而有利于結(jié)石形成。

據(jù)報道，自由基和內(nèi)毒素與膽總管結(jié)石的形成密切相關，而細菌感染又是人體內(nèi)自由基和內(nèi)毒素的重要來源[52-53]。細菌毒素可引起膽管壁炎性反應以及肝細胞損傷，致使肝臟功能異常、代謝紊亂、膽汁成分及理化性質(zhì)改變而有利于膽總管結(jié)石的形成。同時，自由基還是膽紅素鈣結(jié)石形成的觸發(fā)因子[54]。

4 小結(jié)

越來越多的證據(jù)表明膽道微生態(tài)在膽總管結(jié)石的形成過程中發(fā)揮著極其重要的作用，但其作用機制至今尚未完全明了。與傳統(tǒng)的微生物研究方法相比，基于下一代高通量測序技術的宏基因組學從極大的深度和廣度上為人類認識人體微生態(tài)和疾病的關系開辟了新的途徑。因此，聯(lián)合運用宏基因組測序技術和傳統(tǒng)微生物鑒別方法，對于膽總管結(jié)石的發(fā)病機制研究、預防和治療都將具有著重要的意義。