表面活性劑對表面等離子體共振分析的影響

李 輝, 李桂瀾, 董 志

(北京大學 生命科學公共儀器中心, 北京 100871)

表面等離子體共振(surface plasmon resonance,SPR)技術能夠檢測距離傳感芯片表面約100 nm范圍內分子結合和解離導致的折射率的變化,從而實時監測分子間的相互作用。為了研究分子之間的相互作用,讓一種分子固定在芯片上,而另一種分子的溶液流過芯片表面,如果有相互作用,則芯片表面附近的質量變化導致表面等離子體共振響應值的變化,從而分析出兩種物質相互作用的快慢和強弱[1]。

利用表面等離子體共振技術分析分子之間相互作用的過程中,通常會在運行緩沖液中添加非離子型表面活性劑,以盡量減少蛋白質和其他生物分子在流動系統包括芯片表面以及液體流經的管路中發生沉淀及吸附的可能。有文獻報道在特定的條件下,接近臨界膠束濃度的表面活性劑有助于保持蛋白的二級結構[2],各種方法被用于研究表面活性劑防止蛋白沉淀或團聚的機理[3-5],但是不同的蛋白與表面活性劑的作用方式不同,表面活性劑防止蛋白沉淀或團聚的機理也并不明確[6]。

表面活性劑是指加入少量能使溶液體系的界面狀態發生明顯變化的物質。表面活性劑的分子結構具有兩親性：一端為親水基團,另一端為疏水基團。根據表面活性劑在水溶液中是否電離,可以把表面活性劑分為離子型表面活性劑(包括陽離子表面活性劑與陰離子表面活性劑)、非離子型表面活性劑、兩性表面活性劑、復配表面活性劑、其他表面活性劑等。非離子型表面活性劑的親水基團主要由一定數量的含氧基團(一般為醚基和羥基) 構成,在水溶液中不電離因此穩定性高,不易受強電解質無機鹽類存在的影響,也不易受pH值的影響,比較適合應用于生物反應體系。

商業化的表面等離子體共振分析儀配套的運行緩沖液中添加的表面活性劑為聚山梨醇20(polysorbate20,P20)。對于P20的性質以及添加P20對于分子間相互作用實驗結果有何種影響并沒有相關的文獻報道。本文利用等溫滴定量熱儀對P20的性質進行研究。

1 儀器與試劑

表面等離子體共振分析儀BIACORE T200、CM5芯片、N-乙基-N′-(3-二氨基丙基)碳二亞胺(EDC)溶液、0.1mol/L N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶液、10×PBS緩沖液(27 mmol/L KCl,1.37 mol/L NaCl)以及surfactant P20均購自美國通用電氣公司。等溫滴定量熱儀ITC200購自英國馬爾文儀器有限公司。蛋白(分子量70 ku)及與之相互作用的多肽(1 ku)為用戶提供。

2 實驗方法

2.1 臨界膠束濃度的確定

配置含有不同濃度表面活性劑P20的1×PBS-P緩沖液,用其滴定1×PBS緩沖液,滴定速率為0.5 μL/s,間隔120 s,轉速為1 000 r/min,滴定溫度為25℃。數據分析采用MicroCal ORIGIN 軟件。

2.2 配體在芯片表面的固定

配體在芯片表面的固定采用氨基偶聯的方式[7]。將芯片裝入儀器中,以10 μL/min的流速通入0.4 mol/L N-乙基-N′-(3-二氨基丙基)碳二亞胺(EDC)溶液和0.1 mol/L N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶液的混合溶液(體積比為1∶1),活化芯片表面(1通道及2通道)7 min。芯片表面活化后,將配體(蛋白)用10 mmol/L醋酸緩沖液(pH4.5)稀釋至20 μg/mL,以10 μL/min的流速注入芯片表面2通道中,達到所需的固定量后,將1 mol/L乙醇胺以10 μL/min的流速注入芯片表面(1通道及2通道)7 min,滅活剩余的酯鍵。所有反應均在25 ℃的條件下進行。

2.3 分子間相互作用分析

將含有0.05%的P20的1×PBS-P緩沖液作為運行緩沖液,并將分析物(多肽)用1×PBS-P稀釋成不同濃度后通入芯片表面。利用不含P20的1×PBS緩沖液重復上述試驗。數據記錄及分析所用軟件分別為Biacore T200 Control software 以及Biacore T200 Evaluation software。

3 結果與討論

3.1 表面活性劑P20臨界膠束濃度的測定

等溫滴定量熱(isothermal titration calorimetry, ITC)技術是近年來發展起來的一種研究生物熱力學的重要方法。利用高靈敏度、高自動化的微量熱儀連續監測和記錄微量分析物溶液滴加至一定體積的配體溶液中產生的熱量變化,同時提供結合平衡常數(KA)、化學計量比(n)、焓變(ΔH)和熵變(ΔS)等多方面的信息。研究表面活性劑分子的性質、團聚的熱動力學參數、臨界膠束濃度等是等溫滴定量熱技術的一個重要的應用領域[8-11]。研究[11]表明,利用等溫滴定量熱儀測量離子型表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)的臨界膠束濃度得到的滴定曲線為“S”型曲線,每次滴加SDS溶液產生的焓變ΔdilH,以及滴加過程完成后的濃度SDS的關系可以用式(1)進行描述[11],式中a1—a5為擬合參數。滴定曲線的拐點對應的濃度即為臨界膠束濃度。

(1)

本文利用等溫滴定量熱儀對P20的性質進行分析，結果見圖1(Q為熱量，負號表示放熱)。

圖1 利用含有2% P20的PBS緩沖液滴定不含有P20的PBS緩沖液所得的滴定曲線和不同濃度P20的PBS緩沖液滴定不含有P20的PBS緩沖液的放熱量與滴數之間的關系

結果表明，P20在25 ℃的條件下在PBS緩沖液中的稀釋過程為放熱過程,與上述文獻中報道的SDS的滴定曲線不同,并非典型的“S”型曲線,而是與膽汁鹽類表面活性劑的滴定曲線[8]較為類似,滴定產生的焓變并沒有出現跳躍性突變并導致滴定曲線出現明顯的拐點,因此不能準確地測定臨界膠束濃度。由此可以推斷P20作為一種非離子型表面活性劑,即使在很高的濃度下依然可以均勻分布在緩沖液中,不發生明顯的聚集或是形成大的膠束。

從P20的分子結構(圖2)看,P20含有20個氧乙烯單元,但是這20個氧乙烯單元在分子不同側鏈上的分布數目并不固定,因此P20可以看作多種分子的混合物,可能沒有確定的臨界膠束濃度。

3.2 添加表面活性劑P20對表面等離子體共振分析的影響

正常情況下,利用表面等離子體共振技術進行分子間相互作用分析實驗得到的傳感曲線對應分子結合過程的部分應為指數上升曲線,解離部分應為指數下降曲線[12]。

圖3(a)為利用1×PBS作為運行緩沖液進行實驗得到的傳感曲線(2通道響應值扣減1通道響應值)，不同顏色表示不同濃度。從圖中可以看出,傳感曲線形狀并非正常的指數上升曲線。在0 s注入樣品后,曲線迅速上升至大約9后呈現下降的趨勢,然后又逐漸上升,形狀為“凹”線。圖3(b)為利用1×PBS-P作為運行緩沖液進行實驗得到的傳感曲線(2通道響應值扣減1通道響應值)。0 s注入樣品后傳感曲線為比較正常的指數上升曲線。由圖3結果可以看出,運行緩沖液中不添加表面活性劑P20無法得到正常的傳感曲線。

圖2 聚山梨醇20的分子結構

圖3 利用PBS和PBS-P作為運行緩沖液所得傳感曲線

為了進一步分析不添加表面活性劑P20無法得到正常的傳感曲線的原因,對圖3中兩組傳感曲線的參比通道(1通道)以及反應通道(2通道)信號進行了對比分析。

在參比表面由于沒有固定配體,不發生結合反應,因此通入樣品后得到的相對響應值來源于樣品與運行緩沖液之間的折射率差異以及非特異吸附。在無法得到正常的傳感曲線時,通常需要對參比通道的信號進行分析,以便得到樣品的濃度、非特異吸附等方面的信息。圖 4(a)為將25 mmol/L樣品通入芯片表面進行測試,在參比通道(1通道)得到的傳感曲線。從圖中可以看出,在樣品及運行緩沖液中沒有添加表面活性劑P20的情況下,通入樣品產生的相對響應值(綠線)大約為110。添加P20后通入樣品后產生的相對響應值(紅線)為280。添加P20后1通道的相對響應值顯著增加。可能的原因：不添加表面活性劑P20,樣品在管路中的非特異吸附量增加,導致流過芯片表面的樣品的實際濃度低于配制的濃度,因此流過芯片表面的樣品與運行緩沖液的折射率差值減少。

將圖4(a)兩條傳感曲線按照結合點對齊的方式對y軸進行調整后得到圖4(b)圖。從圖4(b)中可以看出,在樣品及運行緩沖液中沒有添加表面活性劑P20的情況下,通入樣品后,參比通道的傳感曲線(綠線)有一個持續緩慢上升的過程。添加P20后,參比通道的傳感曲線(紅線)在注入點之后迅速達到最高點后并保持一定高度,無明顯上升趨勢。產生這種差異的原因可能是：(1)不添加表面活性劑P20,樣品中的分子持續不斷地吸附在芯片的表面的參比通道上,從而產生緩慢上升的信號;(2)不添加表面活性劑P20,樣品在管壁上的非特異吸附造成樣品不均一,首先接觸芯片表面的樣品濃度低于后來接觸芯片表面的樣品濃度，隨著時間的推移,樣品中的濃度逐漸增加至配制濃度；而添加表面活性劑P20之后,樣品在管道中以及芯片表面的非特異吸附都有所減少,樣品均一度提高。

圖5(a)為通入25 mmol/L樣品進行測試,在反應通道(2通道)得到的傳感曲線。從圖中可以看出,在樣品及運行緩沖液中不添加表面活性劑P20的情況下,通入樣品產生的相對響應值(綠線)大約為110。在樣品及運行緩沖液中添加表面活性劑P20的情況下,通入樣品后產生的相對響應值為350,添加表面活性劑P20提高了2通道的相對響應值,與1通道情況類似。與1通道不同的是,不添加表面活性劑P20,反應通道的傳感曲線在注入點之后迅速達到最高點后并保持一定高度,無明顯上升趨勢。添加表面活性劑P20,反應通道的傳感曲線在注入點之后達到最高點后有一個持續上升的過程。

圖4 通入25 mmol/L樣品進行測試,在參比通道(1通道)得到的傳感曲線(綠線對應的運行緩沖液為PBS，紅線對應的運行緩沖液為PBS-P和將(a)圖按照結合點對齊的方式對y軸進行調整后所得傳感曲線(1通道)

圖5 通入25 mmol/L樣品進行測試,在反應通道(2通道)得到的傳感曲線(綠線對應的運行緩沖液為PBS,紅線對應的運行緩沖液為PBS-P)和按照結合點對齊的方式對y軸進行調整后所得傳感曲線(2通道)

圖5(b)為按照結合點對齊方式對y軸進行調整后所得傳感曲線，紅線扣減圖4(a)紅線為利用PBS-P進行實驗得到的最終傳感曲線,為正常的指數上升曲線。圖5(b)綠線扣減圖4(b)圖綠線為利用PBS進行實驗得到的最終傳感曲線,為“凹線”。由此可以看出,添加P20減少了非特異性吸附,增強了特異性吸附,使得傳感曲線由“凹線”變為正常的指數上升曲線。

4 結語

在運行緩沖液及樣品中添加表面活性劑P20,可以減少樣品在流通系統中的非特異吸附,防止待測樣品的實際濃度低于配制濃度,提高特異性結合水平。在一些應用中,特別是那些涉及脂類囊泡和疏水性蛋白的應用中,緩沖液中不使用表面活性劑[1],可能是為了避免表面活性劑與脂類囊泡和疏水性蛋白的相互作。在這類實驗中如何避免樣品在流通系統及芯片表面的非特異吸附需要進一步的研究。