布魯氏菌Omp16蛋白的原核表達與鑒定

李俊萱，吳勝昔，曾 政，李令臣，魯友銘，侯力嘉，李 志，徐 緣，李 紅

(1.重慶理工大學 藥學與生物工程學院， 重慶 400054；2.重慶市動物疫病預防控制中心， 重慶 401120)

布魯氏菌病(brucellosis)(簡稱布病)是由布魯氏菌(Brucella)引發的目前世界上流行廣、危害大的人獸共患病之一。在全球200多個國家和地區中，170多個國家和地區都存在和流行布魯氏菌病，并且主要集中在發展中國家[1]。布魯氏菌也被列為失能性生物戰劑之一，有可能被恐怖主義用來制造恐怖事件[2]。就世界范圍而論,因布魯氏菌病造成的直接經濟損失估計每年可達數十億美元[3-5]。近年來隨著經濟發展，畜牧業的快速發展，牛羊交易頻繁，且交易范圍廣，布病疫情自20世紀90年代中期開始再次持續快速上升，目前已成為我國發病率上升速度最快的傳染病之一[6]。

布魯氏菌是一種無芽孢、無鞭毛、不能運動、革蘭氏陰性胞內寄生的球桿狀微小細菌[7]。布魯氏菌的外膜包括脂多糖、蛋白質和磷脂層，外膜蛋白是布魯氏菌的結構蛋白和功能蛋白，它除了可以維持細菌細胞膜的完整性外，也是布魯氏菌重要的抗原和毒力因子[8]。 Ompl6蛋白是一種具有免疫保護作用的外膜抗原[9]，它是第一個無需外部佐劑就能達到與活弱毒疫苗相同免疫保護水平的布魯氏菌蛋白[10]。本課題構建pET28a(+)-Ompl6重組質粒，并轉化大腸桿菌BL21(DE3)中進行誘導表達，純化出濃度及純度較高的Omp16蛋白，為后續布魯氏菌病的檢測試劑研制及單克隆抗體的制備提供素材。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，購自上海維地生物技術有限公司；原核表達載體pET28a(+)，由重慶理工大學D314實驗室本課題組保存；布魯氏菌Omp16質粒及top10菌株交由生工生物工程股份有限公司構建。

1.2 主要試劑及儀器

快切酶 NdeI、XhoI，均購自寶生物工程有限公司；卡那霉素，購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司；IPTG，購自索來寶科技有限公司；質粒小量快速提取試劑盒，購自北京博邁德生物技術有限公司；蛋白質分子質量標準，購自SMOBIO公司；HRP-羊抗小鼠IgG，購自Proteintech公司；His-tag組氨酸單抗，購自Sigma公司；全波長酶標儀，購自Thermo Fisher Scientific公司；NGCTM色譜系統購自伯樂生命醫學產品(上海)有限公司；Bio-ScaleTM親和層析鎳柱、超靈敏多功能成像儀，均購自美國GE公司。

1.3 序列分析、合成

根據GenBank發表的布魯氏菌Omp16基因序列 (GenBank登錄號： JF918760.1)，分析序列并進行密碼子優化，交由上海生工生物工程股份有限公司全基因合成并測序。

1.4 pET28a(+)-Omp16重組載體的構建

用高純度質粒小量快速提取試劑盒從構建的top10甘油菌提取質粒，并將提取的Omp16質粒用快切酶NdeI和XhoI同時雙酶切，以鑒定質粒構建是否正確。將鑒定正確的Omp16質粒轉化至感受態細胞BL21(DE3)，并用甘油保菌。

1.5 Omp16重組蛋白最佳誘導表達條件的篩選

將重組菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3) 37 ℃振蕩培養至OD600 nm值在0.6～0.8之間，按IPTG濃度梯度(0.1、0.5、1 mmol/L)、溫度梯度(16、25、30、37 ℃)以及時間梯度(4、6、8、10 h)逐步進行篩選，收集菌體進行SDS-PAGE檢測，以確定最佳誘導條件。

1.6 Omp16重組蛋白的大量表達及純化

將重組菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3) 37 ℃振蕩培養至OD600 nm值在0.6～0.8之間，按照篩選的最佳誘導條件進行誘導，并收集菌體。對菌體進行超聲破碎后，用8M尿素溶解包涵體，采用親和層析鎳柱對Omp16目的蛋白進行純化。

1.7 蛋白質免疫印跡(Western-blot)分析

將SDS膠面蛋白電轉(250 mA,40 min)至PVDF膜，用1%BSA(TBST配置)封閉1 h，棄封閉液，TBST洗3次，每次5 min；以His-tag組氨酸單抗為一抗(1∶10 000)，以HRP羊抗鼠IgG為二抗(1∶4 000)，室溫孵育各1 h，將膜加入ECL化學發光檢測試劑顯色，最后用Amersham Imager 600超靈敏多功能成像儀檢測。

2 結果與分析

2.1 重組質粒pET28a(+)-Omp16的酶切鑒定

重組質粒pET28a(+)-Omp16經NdeI和XhoI雙酶切后，酶切產物大小與預期一致(圖1)。

M.DL-2 000 Marker；1.pET28a(+)；2.重組質粒雙酶切產物。

2.2 重組菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3)誘導條件的篩選

首先篩選最適誘導溫度，SDS-PAGE電泳結果表明Omp16重組蛋白主要以包涵體形式表達(見圖2)，故采用37 ℃進行誘導；37℃、IPTG濃度分別為0.1、0.5、1 mmol/L誘導6 h，SDS-PAGE電泳結果表明IPTG濃度為0.5 mmol/L，誘導結果最佳(見圖3); 37℃、0.1 mmol/L IPTG分別誘導4、6、8、10 h，SDS-PAGE電泳結果表明，6 h蛋白表達量最高(見圖4)。故最佳誘導條件為37℃、IPTG為0.5 mmol/L，誘導6 h，如圖2、3、4所示。

M.蛋白分子質量標準; 1.未經IPTG誘導的pET28a(+)-Omp16超聲破碎后沉淀；2、4、6、8：16、25、30、37 ℃(0.5 mmol·L-1IPTG,10 h)條件下重組菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3)經裂解液破碎后的上清；3、5、7、9：16、25、30、37 ℃(0.5 mmol·L-1IPTG,10 h)條件下重組菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3)經裂解液破碎后的沉淀。

圖2 不同誘導溫度條件下的Omp16蛋白表達

2.3 Omp16重組蛋白純化及Western-blot分析

按篩選的最佳誘導條件，對Omp16蛋白大量誘導表達，用8M尿素溶解包涵體，采用親和層析鎳柱對Omp16目的蛋白進行純化，并經15%SDS-PAGE檢測，如圖5所示。Western-blot檢測結果表明：純化的重組Omp16蛋白能夠被His-tag組氨酸單抗識別，于21 ku處出現陽性條帶，與預期相符(圖6)。

M.蛋白分子質量標準; 1.未經IPTG誘導的pET28a(+)-Omp16超聲破碎后沉淀；2.pET28a(+)空載體；3、5、7：37 ℃條件下，IPTG濃度分別為0.1、0.5、1 mmol·L-1，誘導6 h后重組菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3)經裂解液破碎后的上清；4、6、8：37 ℃條件下，IPTG濃度分別為0.1、0.5、1 mmol·L-1，誘導6 h后重組菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3)經裂解液破碎后的沉淀。

圖3 不同IPTG誘導濃度條件下的Omp16蛋白表達

M.蛋白分子質量標準; 1.未誘導對照；2.pET28a(+)空載體；3、4、5、6：37 ℃條件下， IPTG濃度為0.5 mmol·L-1時分別誘導4、6、8、10 h。

圖4 不同誘導時間的Omp16蛋白表達

M.蛋白分子質量標準；1.未經IPTG誘導的pET28a(+)-Omp16超聲破碎后沉淀；2.重組菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3) 經裂解液破碎后的沉淀；3.重組菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3) 經裂解液破碎后的上清；4-6：Omp16穿透液；7-9.Omp16純化蛋白。

圖5 純化后的Omp16蛋白的SDS-PAGE電泳結果

1.未經IPTG誘導的重組菌pET28a(+)-Omp16/BL21(DE3)原菌液；2pET28a(+)空載體；3-4.純化后的重組Omp16蛋白。

圖6 Western-blot鑒定重組Omp16蛋白

3 討論

布魯氏菌可感染多種家畜和野生動物，人亦可被感染，人群發病主要是因為接觸帶菌動物或食用病畜及其乳制品，也可經皮膚、粘膜、交配感染，吸血昆蟲也能傳播此病[11]。 布魯氏菌可以通過各種途徑破壞機體屏障侵入吞噬或非吞噬細胞。由于其具有躲避巨噬細胞殺傷作用的能力，布魯菌在宿主體內增長迅速，這也是布病易轉為慢性病的原因[12]。人感染后臨床主要表現為出現波狀發熱，多汗，全身乏力，關節腫痛，肝脾，淋巴結和睪丸腫大以及神經和生殖系統病變等，嚴重者喪失生殖和勞動能力。人類在感染布魯氏菌病后由于缺少明顯的癥狀經常會造成診斷錯誤從而延誤病情，到目前為止也沒有有效的根治方法，只能做到控制和延緩該病的發作，導致患者在承擔病痛的同時還要承擔巨大的經濟和心理壓力，對我國醫療衛生事業造成較大影響[13]。

布魯氏菌外膜蛋白具有免疫原性和抗原保護作用[14]。根據分子量大小將布魯氏菌外膜蛋白分為3組：第1組分子量范圍10～19 ku，是一類脂蛋白；第2組蛋白質分子量范圍在36～38 ku，為膜孔蛋白；第3組蛋白為分子量范圍在25～34 ku之間的外膜蛋白[15]。Omp16是一種脂蛋白，它能在所有的布魯氏菌種中表達，由于其脂質部分具有佐劑活性，無需外部佐劑即可誘導小鼠特異性CD4(+)和CD8(+) T細胞產生γ干擾素，其免疫保護效果與減毒活疫苗S19相似[9]，而且未脂化Ompl6 的蛋白質部分能激活細胞內的樹突狀細胞，誘導Thl細胞發生特異性免疫[10]。熊流新等[16]通過原核表達獲得Omp16蛋白，并證實其能夠刺激小鼠產生高滴度的多克隆抗體。王勇等[17]將Omp16蛋白作為包被抗原建立間接ELISA方法檢測布魯氏菌陽性血清，具有良好的免疫反應性，并且與常見牛病陽性血清之間無交叉反應。因而獲得高純度的Omp16蛋白對于后續進一步研究具有非要重要的意義。

目前布魯氏菌病診斷方法主要包括細菌學診斷方法、血清學診斷方法、分子生物學檢測方法等[18]。細菌學檢查分離率低、耗時耗力，且布魯氏菌可通過浮塵傳播，危險程度較高，已經逐步被淘汰[19]。血清學診斷方法操作簡便、迅速，已逐漸得到廣泛的應用。墨西哥學者Dajer等應用同質熒光偏振試驗來診斷牛布魯氏菌病，研究發現FPA是一種能替代CFT的試驗[20]。張付賢等[21]研制了膠體金試紙條檢測小鼠布魯氏菌感染血清，敏感性高，簡便快速。由于血清學診斷方法靈敏度及特異性較差，且不能區分疫苗免疫和自然感染，因此難以真正實現準確監測和診斷疾病。分子生物學檢測方法所需樣本量少，操作簡單，可以彌補這些方法的不足[22]。分子生物學診斷技術包括PCR診斷技術和基因檢測技術等。徐軍等[23]建立了檢測乳中布魯氏菌omp22基因的巢式PCR方法，反復驗證發現，該檢測方法有較好的重復性和穩定性。

本研究對布魯氏菌Omp16基因進行密碼子優化，全基因合成基因片段并構建重組質粒。通過篩選得到Omp16蛋白的最適誘導條件為37 ℃、0.5 mmol/L,IPTG誘導6h，此時蛋白表達量最高，且主要以包涵體的形式存在。用8M尿素溶解包涵體后，采用親和層析鎳柱對Omp16目的蛋白進行純化，經15% SDS-PAGE電泳檢測，結果發現重組蛋白純度達到了電泳純。本研究制備的Omp16蛋白將為后續單克隆抗體的制備和布魯氏菌病的檢測提供了可靠素材。