肝素親和柱在乳鐵蛋白檢測中的應(yīng)用優(yōu)化

樓飛，楊秀敏，章寅

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院莊行綜合試驗(yàn)站，上海201415；2.沈陽市動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽110034；3.上海德諾產(chǎn)品檢測有限公司，上海200436）

乳鐵蛋白是近年來國內(nèi)外開發(fā)研究速度較快的一種營養(yǎng)添加劑，由于其具有：廣譜抗菌，抗病毒感染作用；能調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵平衡；調(diào)解骨髓細(xì)胞的生成；抑制人體腫瘤細(xì)胞的作用；能同多種抗生素及抗真菌制劑協(xié)同作用，有效地治療疾病等功效，使其產(chǎn)品在國內(nèi)外食品加工中的應(yīng)用范圍日益廣泛[1-2]。乳鐵蛋白是一種極具營養(yǎng)價(jià)值的活性糖蛋白，對嬰幼兒或者成人的健康具有重要的意義[3-4]。GB14880-2012我國《食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白的最大允許使用量為1.0 g/kg，而目前國內(nèi)外未建立乳鐵蛋白測定相關(guān)的國家標(biāo)準(zhǔn)。文獻(xiàn)中報(bào)道的測定乳鐵蛋白含量的方法大致可以歸為以下幾類：酶聯(lián)免疫吸附法、十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法和高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法[5-7]。

其中，酶聯(lián)免疫吸附法是將抗原、抗體特異性反應(yīng)和酶的高效催化作用有機(jī)結(jié)合起來的一種新穎、快速的免疫學(xué)分析技術(shù)，具有靈敏度高、檢測限低、樣品無需純化等特點(diǎn)，因此該法應(yīng)用范圍最廣、常用于包括初乳和乳粉等一系列產(chǎn)品中的乳鐵蛋白質(zhì)量濃度的測定，但該法所用試劑盒昂貴，不適于長期大量檢測乳鐵蛋白。SDS-PAGE法具有測定準(zhǔn)確快速、操作簡便等特點(diǎn)，適用于初步分離效果的監(jiān)控，但對純度較低的乳鐵蛋白檢測時(shí)，由于乳鐵蛋白與其他雜蛋白分子量相近，很難達(dá)到分離，故僅適用于高純度的樣品測定。毛細(xì)管電泳法由于進(jìn)樣量少，因而制備能力差，而且由于毛細(xì)管直徑比較小，造成了靈敏度較低，重現(xiàn)性差等一系列缺點(diǎn)。

高效液相色譜法擁有分離效率高，選擇性好，檢測靈敏度高，操作自動化等優(yōu)點(diǎn)，是目前食品檢測領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的方法之一。乳鐵蛋白的等電點(diǎn)為8.2左右，是一種分子量為80 kDa，具有大約700個氨基酸殘基序列的單體糖蛋白，并連接1～2個配糖體（配糖體成分約占7%）[8-10]。乳鐵蛋白一共有兩個鐵離子結(jié)合位，每個結(jié)合位可以與一個鐵離子結(jié)合。現(xiàn)已有多篇文獻(xiàn)研究報(bào)道應(yīng)用高效液相色譜檢測乳制品中的乳鐵蛋白含量，前處理方法包括：（1）樣品采用脫脂，酸法去除酪蛋白，硫酸銨沉淀富集，纖維素濾膜過濾凈化等方法進(jìn)行預(yù)處理[11-12]；（2）通過額外加入的二價(jià)鐵離子使乳鐵蛋白的構(gòu)型更利于沉淀，然后用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液沉淀蛋白除去糖分，再用醋酸鹽緩沖液提取乳鐵蛋白并分離掉酪蛋白進(jìn)行預(yù)處理[13-14]；（3）樣品采用0.5 mol/L氯化鈉溶液溶解，稀釋至適當(dāng)濃度作為預(yù)處理等方法[15]。

肝素是一種含硫酸酯的酸性多糖，有文獻(xiàn)報(bào)道乳鐵蛋白可與這類多負(fù)電荷分子糖胺多糖通過親和層析結(jié)合[16-18]。本標(biāo)準(zhǔn)中采用HiTrapTMHeparin HP（1 mL）肝素親和柱作為目標(biāo)化合物純化和濃縮的前處理步驟[19-20]，由于是首次將該親和柱應(yīng)用到乳鐵蛋白的檢測中，故對應(yīng)用條件進(jìn)行了摸索和優(yōu)化，包括：肝素親和柱的承載量、淋洗液和洗脫液的濃度、pH值等參數(shù)的優(yōu)化等，建立一種適合乳鐵蛋白檢測的前處理凈化方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（批號：SP113101）：Tatua公司提供；乙腈為（色譜純）：美國默克公司；無水乙醇、氯化鈉、磷酸、磷酸氫二鈉、三氟乙酸（均為分析級）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；超純水：美國賽默飛世爾科技有限公司；高效液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；HiTrapTMHeparin HP（1 mL）肝素親和柱：美國通用電氣醫(yī)療集團(tuán)；Jouan Ceterifuge MR23i離心機(jī)：美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 肝素親和柱的應(yīng)用比較

本方法中采用HiTrapTMHeparin HP（1 mL）肝素親和柱作為目標(biāo)化合物純化和濃縮的前處理步驟。通過經(jīng)過和未經(jīng)過肝素親和柱純化的樣品色譜圖，分析其對乳鐵蛋白檢測應(yīng)用的可行性。

1.2.2 肝素親和柱承載量的測定

該款肝素親和柱對乳鐵蛋白純化和濃縮的前處理步驟未有報(bào)道，親和柱的承載量對方法的準(zhǔn)確度方面有很大的影響，故在本方法中進(jìn)行了承載量的試驗(yàn)。采用40 μg～10 000 μg不同的上柱量測定回收率的方式，選定承載量范圍值。

1.2.3 磷酸鹽濃度的優(yōu)化

前處理過程中需要分離純化乳鐵蛋白，故首先要求將乳鐵蛋白從基質(zhì)中以溶解的狀態(tài)釋放出來，并保持原先的天然狀態(tài)，不丟失生物活性。故在本方法中進(jìn)行磷酸鹽濃度的優(yōu)化，通過奶粉本底和加標(biāo)回收率的測定，在磷酸鹽pH=7.0的條件下，依次選擇濃度為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mol/L 進(jìn)行比較。

1.2.4 磷酸鹽pH值的優(yōu)化

乳鐵蛋白是一種分子量為80 kDa，具有大約700個氨基酸殘基序列的單體糖蛋白，并連接1個～2個配糖體。對于這一類大分子量的蛋白質(zhì)，pH值對其的結(jié)構(gòu)有一定的影響。故在本方法中進(jìn)行磷酸鹽pH值的優(yōu)化，通過奶粉本底和加標(biāo)回收率的測定，在磷酸鹽濃度為0.2 mol/L的條件下，依次選擇pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 進(jìn)行比較。

1.2.5 洗脫液鹽濃度的優(yōu)化

洗脫步驟屬于肝素親和柱使用過程中比較關(guān)鍵的步驟，在此步驟中乳鐵蛋白目標(biāo)化合物將從親和柱中被洗脫下來，故洗脫液的濃度對整個試驗(yàn)比較關(guān)鍵。選定Na2HPO4的濃度為0.05 mol/L，pH=7.0，設(shè)定4個不同濃度的 NaCl濃度即 0.25、0.50、1.0、2.0 mol/L，通過加標(biāo)回收測定，選定最佳的NaCl濃度。

1.2.6 洗脫液pH值的優(yōu)化

同樣原理，選定0.05 mol/L的Na2HPO4，1.0 mol/L濃度的NaCl，設(shè)定5個不同的pH值即5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，通過加標(biāo)回收測定，選定最佳的pH值。

1.2.7 肝素親和柱洗脫體積的測定

本方法中采用1 mL規(guī)格的HiTrapTMHeparin HP親和柱，乳鐵蛋白的上柱量控制在 100 μg～10 000 μg，試驗(yàn)設(shè)計(jì)當(dāng)乳鐵蛋白的上柱量為最大值即10 000 μg時(shí)，分別收集第 1 mL，第 2 mL，第 3 mL，第 4 mL，第5 mL，第6 mL～8 mL的洗脫液，上機(jī)測定。

1.2.8 自制肝素親和柱性能的比較

目前市場上使用率最高的肝素親和柱是由美國通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生產(chǎn)的HiTrapTMHeparin HP親和柱，為了驗(yàn)證乳鐵蛋白檢測是否只能依靠該款親和柱，本試驗(yàn)采用偶聯(lián)有肝素分子的瓊脂糖作為填料自制了一批肝素親和柱。將自制的肝素親和柱與Hi-TrapTMHeparin HP肝素親和柱在相同的試驗(yàn)條件下進(jìn)行回收率的測定。

1.3 液相色譜條件

色譜柱規(guī)格：C4，5 μm，300A°（孔徑），250 mm×4.6 mm（內(nèi)徑）；檢測波長：280 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：50 μL；流速：1.0 mL/min；流動相：0.1%三氟乙酸溶液和乙腈，梯度洗脫參數(shù)見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序表Table 1 Optimization of gradient elution

2 結(jié)果與分析

2.1 肝素親和柱的應(yīng)用比較

圖1為經(jīng)過和未經(jīng)過肝素親和柱純化的樣品液相色譜比較圖。

圖1 肝素親和柱純化樣品比較色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of lactoferrin with heparin affinity column cleanup and without

從色譜圖1中可以看出未純化的樣品成分復(fù)雜，難以滿足檢測需要，經(jīng)過肝素親和柱純化的樣品，雜質(zhì)少，峰形好，符合檢測的要求。

2.2 肝素親和柱承載量的測定

1 mL HiTrapTMHeparin HP肝素親和柱對乳鐵蛋白承載量的測定結(jié)果見表2。

表2 1 mL HiTrapTMHeparin HP肝素親和柱對乳鐵蛋白承載量的測定（n=3）Table 2 Determination of the bearing capacity of lactoferrin by 1 mL HiTrapTMHeparin HP（n=3）

從表2可知，當(dāng)乳鐵蛋白的上柱量達(dá)到100 μg時(shí)，1 mL規(guī)格的HiTrapTMHeparin HP肝素親和柱的回收率就達(dá)到90%以上，乳鐵蛋白的上柱量在100 μg～10 000 μg時(shí)，回收率在 93.8%～105%之間，符合試驗(yàn)要求。故本試驗(yàn)中將樣品中乳鐵蛋白的上柱量控制100 μg～10 000 μg之間，如果試驗(yàn)中遇到高濃度乳鐵蛋白含量的樣品時(shí)，需將樣品稀釋至合適的濃度后再使用親和柱；反之則可適當(dāng)增加稱樣量和上柱體積。

2.3 磷酸鹽濃度的優(yōu)化

磷酸鹽濃度的優(yōu)化結(jié)果見表3。

表3 磷酸緩沖液濃度優(yōu)化表（n=3）Table 3 Optimization of phosphate buffer concentration（n=3）

從表3數(shù)據(jù)得知，隨著磷酸緩沖液濃度的增加，回收率先增加后降低至零，當(dāng)磷酸緩沖液濃度達(dá)到0.4 mol/L時(shí)，回收率為0，故選定乳鐵蛋白檢測時(shí)磷酸緩沖液濃度為0.2 mol/L，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在該濃度下目標(biāo)峰附近的雜質(zhì)最少，符合試驗(yàn)要求。

2.4 磷酸鹽pH值的優(yōu)化

磷酸鹽pH值的優(yōu)化結(jié)果見表4。

表4 磷酸緩沖液pH優(yōu)化表（n=3）Table 4 Optimization of phosphate buffer pH（n=3）

從表4可知，隨著磷酸緩沖液pH值的增加，回收率先增加后降低，整體數(shù)值在72.3%～91.3%之間，當(dāng)磷酸緩沖液pH值為8.0時(shí)回收率為最大，同時(shí)此pH值下目標(biāo)峰附近的雜質(zhì)最少，符合試驗(yàn)要求。

2.5 洗脫液鹽濃度的優(yōu)化

洗脫液鹽濃度的優(yōu)化結(jié)果見表5。

從表5可知，隨著NaCl濃度的增加，回收率相應(yīng)增加。高濃度的NaCl有利于乳鐵蛋白從親和柱中的洗脫。但2.0 mol/L的NaCl容易造成液相色譜儀的損傷，不利于機(jī)器穩(wěn)定狀態(tài)的保持，故選定1.0 mol/L的NaCl作為洗脫濃度。

表5 洗脫液鹽濃度優(yōu)化表（n=3）Table 5 Optimization of NaCl concentration（n=3）

2.6 洗脫液pH值的優(yōu)化

洗脫液pH值的優(yōu)化結(jié)果見表6。

表6 磷酸緩沖液pH優(yōu)化表（n=3）Table 6 Optimization of phosphate buffer pH（n=3）

從表6試驗(yàn)結(jié)果可以得知，不同的pH值下，回收率范圍為94.9%～98.0%，最高值和最低值的相對相差3.2%，故選定常規(guī)的pH=8。

2.7 肝素親和柱洗脫體積的測定

肝素親和柱洗脫體積的測定結(jié)果見表7。

表7 肝素親和柱洗脫體積的測定（n=3）Table 7 Optimization of elution volume（n=3）

由表7可知1 mL規(guī)格的HiTrapTMHeparin HP肝素親和柱，乳鐵蛋白的上柱量為10 000 μg時(shí)，收集到的第1 mL和第2 mL的洗脫液中乳鐵蛋白總的洗脫率達(dá)到96.5%以上，第3 mL洗脫液中乳鐵蛋白的洗脫率為 0.15%，第 4 mL，第 5 mL，第 6 mL～8 mL的洗脫液中未檢測到乳鐵蛋白，故本試驗(yàn)中選定收集洗脫液的體積為3.0 mL。

2.8 自制肝素親和柱性能的比較

自制肝素親和柱性能的比較結(jié)果見表8。

表8 自制肝素親和柱性能的比較（n=3）Table 8 Comparison of the properties of homemade heparin affinity columns（n=3）

由表8可知，在相同的試驗(yàn)條件下上海德諾產(chǎn)品檢測有限公司的實(shí)驗(yàn)室自制的親和柱平均回收率為97.6%，相對相差1.4%，HiTrapTMHeparin HP肝素親和柱的平均回收率100.4%，相對相差1.9%，柱效比較接近，證明同類型的肝素親和柱可以使用到本方法中用于乳鐵蛋白的檢測。

3 結(jié)論

本文首次提出將肝素親和柱應(yīng)用到乳鐵蛋白檢測前處理過程中，優(yōu)化之后的前處理過程包括：試樣中的乳鐵蛋白經(jīng)磷酸氫二鈉溶液（0.20 mol/L，pH=8.00±0.5）提取，HiTrapTMHeparin HP 1 mL 規(guī)格的親和柱經(jīng)上述磷酸氫二鈉溶液活化后，上樣，經(jīng)過磷酸氫二鈉溶液淋洗，磷酸氫二鈉-氯化鈉溶液（磷酸氫二鈉0.05 mol/L，NaCl 1 mol/L，pH=8.00±0.5）洗脫，并定容至3.0 mL，上機(jī)測定。本方法與文獻(xiàn)中報(bào)道的方法相比，具有檢測成本低、操作方便簡單、耗時(shí)較短、重復(fù)性好、靈敏度高的優(yōu)勢，能滿足目前乳鐵蛋白的日常檢測任務(wù)。