食源性致病菌近紅外光譜分類鑒別的影響因素

馬凱旋，劉建學，2，*，韓四海，2，李璇，2，李佩艷，2，徐寶成，2，羅登林，2

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南洛陽471023；2.河南省食品原料工程技術研究中心，河南洛陽471023）

近年，食品安全問題惡性事件在全球范圍頻頻爆發，無論是發達國家還是發展中國家，都面臨著食品安全問題。由食源性致病菌引起食品中毒事件的發生率在全球范圍內占很大比重，對人類健康造成極大的危害，是隱藏在我們生活中的重大隱患[1-3]。然而隨著經濟的發展和新技術、化學品的廣泛應用，新的食源性疾病不斷出現，食品安全的形勢變得更加嚴峻，如何快速高效地檢測食源性致病菌已成為近年來的研究熱點。

近紅外光譜分析技術具有高靈敏性、指紋特征、分析速度快，在對食源性致病菌進行鑒別時，樣品的前處理至關重要，因此有必要對近紅外光譜技術用于致病細菌分類鑒別的影響因素進行探究[4-6]。在細菌的培養過程中，不同的培養條件可能會影響代謝產物發生變化，直接引起樣品近紅外譜圖的變化。由吳海[7]研究發現，金黃色葡萄球菌在不同的pH值培養以及黑曲霉菌在不同培養基培養下，對所采集的紅外光譜圖進行分析、比較，發現不同培養環境下的微生物譜圖雖然有重現性，但也存在可以用肉眼直接觀察到的譜帶差異，這種譜帶差異是否可以通過化學計量學分析方法進行區分作者并未進行研究。

細菌在不同的生長期階段對培養液的利用情況存在差異性，且代謝特征也不同，從而其所產生的代謝產物也必然不同[8]。陳麗萍等[9]利用PEN3電子鼻化學傳感器對食源性致病菌進行檢測，研究了細菌在培養 2、4、6、8、10 h 后所產生的氣體成分具有差異性，這種差異主要是細菌在相同的培養基中培養不同時間，對培養基的營養物質利用情況不同，所產生的氣味在電子鼻傳感器上呈現不同的響應信號。近紅外光譜技術能否對這些差異識別出來，尚缺乏相關研究。目前研究都是直接對食源性致病菌進行分類鑒別，對細菌在不同培養條件下的光譜進行比較，沒有對培養條件的不同是否會影響近紅外光譜技術對細菌的檢測結果進行研究。雖然光譜的預處理可以減少噪聲和樣品量不同所產生的差異，但近紅外光譜技術能否完全消除濃度間的差異尚缺乏試驗驗證，這對樣品制備及結果分析至關重要。因此，本文針對此問題探究不同濃度、不同培養階段等對近紅外光譜技術用于細菌分類鑒別的影響。這將會為近紅外光譜技術廣泛用于細菌分類、鑒定及檢測提供重要的方法依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸埃希氏菌O157∶H7、金黃色葡萄球菌：中國科學院微生物研究所；單增李斯特菌：河南省洛陽市疾病預防與控制中心；營養肉湯培養基、營養瓊脂培養基：北京奧博星公司；0.9%生理鹽水、氯化鈉：天津科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

VECTOR-33型傅里葉變換近紅外光譜儀：德國Bruker公司；UV-2600紫外可見分光光度計：日本Shimadzu公司；TGL-20M型高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；YXQ-LS-50S型自動高壓滅菌鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；DHP-9272型電熱恒溫培養箱、DHP-9420A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；HYL-A全溫搖瓶柜：太倉市強樂實驗設備有限公司；SW-CJ型超凈工作臺：蘇州安凈凈化科技有限公司；SZ93-1型自動雙重純水蒸餾器：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 不同濃度樣品制備

取-80℃保藏的菌種放置室溫，無菌操作吸取大腸埃希氏菌O157∶H7、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌各1 mL于營養肉湯培養基，37℃，180 r/min振蕩培養12 h，蘸取菌液接種于營養瓊脂培養基，37℃條件下培養使其復蘇，挑取純化培養后的單菌落接種于營養肉湯培養基，37℃，180 r/min振蕩培養，用紫外可見分光光度計測其OD600，用于估計菌液濃度。

將培養至對數期的菌懸液在4℃，5 000 r/min，10 min的高速冷凍離心機分離菌體，用0.9%生理鹽水洗滌兩次，再用蒸餾水洗滌一次，離心后舍棄上清液，用10 mL 0.9%生理鹽水洗滌沉淀部分，充分振蕩使菌體均勻分布，將菌液進行梯度稀釋103、105、107倍，對應菌落數分別為 105、103、10 CFU/mL。每個樣品做4個平行，每個平行做3次重復。

1.3.2 不同培養階段樣品制備

于37℃下接種營養肉湯培養基，180 r/min振蕩培養至各細菌的延滯期、對數期、穩定期和衰退期，用紫外可見分光光度計測其OD600，用于估計菌液濃度。將各時期培養后的菌懸液在4℃，5 000 r/min，10 min的高速冷凍離心機分離菌體，用0.9%生理鹽水洗滌兩次，再用蒸餾水洗滌一次，離心后舍棄上清液，用10 mL 0.9%生理鹽水洗滌沉淀部分，充分振蕩使菌體均勻分布。每個樣品做4個平行，每個平行做3次重復。

1.3.3 檢測樣品近紅外光譜的采集

在溫度25℃、濕度60%左右條件下，利用VECTOR-33型傅里葉變換近紅外光譜儀采集樣品的透射光譜圖。以空白比色皿作為光譜的背景采集，掃描范圍12 000 cm-1～4 000 cm-1，分辨率 8 cm-1，掃描次數 32 次。

1.3.4 光譜數據的預處理及數據分析

利用The Unscrambler X10.4分析軟件對不同濃度、不同培養階段的3種致病菌所采集的近紅外譜圖，進行Savitzky-Golay卷積平滑、矢量歸一化等預處理。其目的主要是：近紅外原始光譜波段中存在大量與樣本自身性質無關的冗余和噪聲信息，會影響后續數據的分析，所以需要對光譜數據進行預處理，以消除在試驗或者檢測過程中易受到樣品采集量、采集光譜的環境所造成光譜漂移、傾斜現象等因素對試驗結果的干擾[10-11]。

主成分分析[12-13]（principal component analysis，PCA）是一種較為成熟的多元統計分析方法，是數據壓縮和特征信息提取技術。運用PCA方法可以減少數據維數，轉換原變量，并且不會降低光譜間的差異信息，這類分析方法可在事先未知類別的情況下對光譜數據進行分析。

將預處理后的不同濃度、不同培養階段致病菌12 000 cm-1～4000 cm-1波數范圍的光譜數據分別導入MATLAB R2014a軟件，進行主成分分析分別得到不同濃度、不同培養階段近紅外光譜的主成分聚類分布圖。

2 結果與分析

2.1 致病菌的濃度對近紅外分類鑒別的影響

將培養至對數期的大腸埃希氏菌O157∶H7、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌分別稀釋103、105、107倍，不同稀釋度的3種致病菌近紅外透射平均光譜圖見圖1所示。

利用The Unscrambler X10.4軟件分別對其進行Savitzky-Golay卷積平滑、矢量歸一化等預處理，能在一定程度上消除因噪聲和樣品量不同產生的光譜差異。由圖1可以看出，這3種致病菌的不同稀釋度近紅外圖譜的差異性初步體現出來，但仍無法將不同稀釋度的3種致病菌很好的區分。因此需要先進行數學預處理，提取特征光譜信息，采用主成分分析法作進一步的數據處理。經預處理后，將3種致病菌不同稀釋度的數據進行PCA分析，匯于表1，得到3種致病菌PC1、PC2的累積貢獻率，通常主成分的累積貢獻率超過85%以上即可使用[14]。

圖1 3種致病菌不同稀釋度的近紅外透射平均光譜圖Fig.1 Near infrared transmission average spectrum of three kinds of pathogenic bacteria with different dilutions

表1 3種致病菌的PCA累積貢獻率Table 1 PCA cumulative contribution rate of three pathogenic bacteria

由表1可知，3種致病菌不同濃度的累積貢獻率均在90%以上，解釋了原始變量的大部分信息，所以采用具有代表性的前2個主成分建立聚類分布模型。以主成分 1（PC1）和主成分 2（PC2）作為聚類依據，主成分聚類分布結果見圖2、圖3、圖4所示。

圖2 大腸埃希氏菌O157∶H7不同濃度的PCA聚類分布圖Fig.2 PCA cluster distribution drawing of E.coli O157：H7 at different concentrations

圖3 單增李斯特菌不同濃度的PCA聚類分布圖Fig.3 PCA cluster distribution drawing of Listeria monocytogenes at different concentrations

圖4 金黃色葡萄球菌不同濃度的PCA聚類分布圖Fig.4 PCA cluster distribution drawing of Staphylococcus aureus at different concentrations

通過PCA分析3種致病菌不同濃度的菌液，可觀察到各自分析數據點分布較為集中，沒有重疊。試驗結果表明近紅外光譜對致病菌的響應較為靈敏，主成分分析的區分度較強，在稀釋107倍較低濃度下仍能對其進行識別。由此可知，近紅外光譜技術對致病菌的濃度比較敏感，盡管對光譜進行預處理，能在一定程度上消除光譜的差異，但這并非絕對。較大的濃度差異將會影響近紅外光譜技術對致病菌的檢測結果。因此在對細菌進行檢測時，樣品濃度這一指標不可忽視，應統一樣品的濃度，減少后期數據分析的難度。

2.2 致病菌的不同培養階段對近紅外分類鑒別的影響

3種致病菌培養至各細菌的延滯期、對數期、穩定期和衰退期的近紅外透射平均光譜圖見圖5。

圖5 3種致病菌不同培養階段的近紅外透射平均光譜圖Fig.5 Near infrared transmission average spectrum of three kinds of pathogenic bacteria with different culture phases

由圖5可以看出，這3種致病菌的不同培養階段間近紅外譜圖的整體趨勢非常接近，說明所含物質的基團是相似的，對光譜的吸收峰位差異極小，無法用肉眼直接區分。經預處理后，將3種致病菌不同培養階段的光譜數據進行PCA分析，匯于表2，得到3種致病菌PC1、PC2的累積貢獻率。

由表2可知，不同培養階段3種致病菌的累積貢獻率均在95%以上，解釋了原始變量的大部分信息，所以采用前2個主成分建立聚類分布模型具有代表性。將不同培養階段的3種致病菌進行PCA分析，聚類分布結果如圖6、7、8所示。

表2 3種致病菌的PCA累積貢獻率Table 2 PCA cumulative contribution rate of three pathogenic bacteria

圖6 大腸埃希氏菌O157∶H7不同培養階段的PCA聚類分布圖Fig.6 PCA cluster distribution drawing of E.coli O157：H7 at different culture phases

圖7 單增李斯特菌不同培養階段的PCA聚類分布圖Fig.7 PCA cluster distribution drawing of Listeria monocytogenes at different culture phases

圖8 金黃色葡萄球菌不同培養階段的PCA聚類分布圖Fig.8 PCA cluster distribution drawing of Staphylococcus aureus at different culture phases

3種致病菌不同培養階段的分析數據點各自位于一定的區域范圍，分布較為集中，無重疊部分并且PCA累積貢獻率較高，說明近紅外光譜技術對致病菌的檢測受不同培養階段的影響。由于不同屬的細菌菌體所具有的酶系統不同，從而分解能力差別較大，在同樣的培養基中培養不同時間，對培養基中的營養物質利用情況和所產生的產物就會不同，揮發物的濃度亦有差異，其所對應的光譜特征也不盡相同。檢測結果表明近紅外光譜技術可以將同一細菌的不同培養階段進行區分?？赡艿脑蚴牵航t外光譜反映的是整個細胞組分的化學鍵振動情況，由于不同培養階段的細菌體內產生的代謝成分不同，通過對近紅外的特異吸收將其有效的區分。

3 結論

近紅外光譜技術具有高靈敏性，在致病菌檢測中對樣品的前處理至關重要，不同培養條件會使細菌的代謝特征發生變化，從而影響近紅外光譜的變化并造成檢測結果的誤差。在樣品的制備過程，光譜采集及數據的處理須嚴謹、規范。通過對不同培養條件的光譜分析進行驗證，由PCA分析結果可知：細菌濃度、培養時間均會干擾致病菌的近紅外譜圖并影響檢測結果。因此，在應用近紅外光譜技術對致病菌進行檢測時，應對樣品的濃度、培養時間進行統一，減少后續數據分析的難度，提高鑒別的準確度。