酶解低值河蟹高壓浸提液制備蟹味香料

仇泓博，樊曉盼，吳晨燕，任小青

（天津農學院食品科學與生物工程學院，天津300384）

我國處于亞熱帶和溫帶地區，氣溫適宜，有利于河蟹的生長繁殖，河蟹養殖產量居世界第一[1]。河蟹味道鮮美，營養價值高，包括蛋白質、碳水化合物、脂肪、磷、鐵、VA、VB1、VB2、煙酸、蟹紅素、蟹黃素等，是一種優質水產蛋白源[2]。蟹殼中含豐富的鈣、多糖、甲殼素，具有良好的抗氧化作用[3]。目前河蟹常被加工成醉蟹、蟹肉罐頭、蟹肉松、蟹油、蟹黃醬等[4-5]，但加工過程中個體較小或斷肢殘肢的低值河蟹無法得到有效的利用，直接丟棄，不僅造成蛋白資源的極大浪費，而且對環境造成嚴重污染[6]。

酶解是加工低值河蟹的一種有效渠道。酶解可以使河蟹中不易被利用的蛋白質轉變為肽和游離氨基酸。食品加工過程中，原料中的蛋白質等含氮化合物在酶的作用下降解，可以產生特征風味物質，改善不良風味，更易被消費者接受[7]。陳啟航等[8]利用木瓜蛋白酶對金槍魚蒸煮液進行酶解，去除了腥味，制成一種魚香濃郁的天然調味品。Li[9]用風味蛋白酶對羅非魚進行酶解后，具有良好風味而沒有任何異味。張永生等[10]采用復合蛋白酶和胰蛋白酶處理雞肉，得到一類口感醇厚，持續性好的雞肉香精。Suroukat[11]采用胃蛋白酶對雞頭骨蛋白進行酶解，確定了最佳酶解條件，并檢測到酶解液中含有豐富的氨基酸，為肉味香料的制備提供了前體物質。Wei等[12]用堿性蛋白酶和風味蛋白酶水解亞麻籽蛋白，得到的水解產物口感提升，苦味顯著降低。

因此，本試驗以低值河蟹為原料，對其先進行高壓浸提，隨后對高壓浸提液進行酶解，以水解度和氨基態氮為評價指標，通過響應面優化風味蛋白酶和木瓜蛋白酶單獨添加時的酶解條件，為進一步研究多酶復配酶解技術提供參考，為工業化生產蟹味香料提供理論和數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低值河蟹：可可溢香（江蘇）味業有限公司；風味蛋白酶（酶活500 LAPU/g）：丹麥諾維信酶制劑有限公司；木瓜蛋白酶（酶活2×105U/g）：廣西龐博生物工程有限公司；氫氧化鈉、酚酞、甲醛（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

FA2004精密分析天平：上海精科儀器公司；SX-500高壓蒸汽滅菌鍋：日本TOMY有限公司；THZ-98AB型恒溫振蕩器：上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蟹味香料制備

將洗凈的河蟹放入沸水中燙漂3 min至外殼變紅，取出瀝干后絞碎。稱取25 g絞碎的河蟹，按質量比1∶4的比例添加100 g水，在壓力0.1 MPa、浸提溫度120℃條件下浸提2 h得到河蟹蛋白浸提液；冷卻后加入蛋白酶，恒溫搖床上振蕩酶解；沸水浴加熱20 min使蛋白酶完全失活；過濾，得蟹味香料。

1.3.2 響應面優化試驗

根據風味蛋白酶推薦使用條件即溫度40℃～60℃、添加量為底物質量的0.01%～0.1%，木瓜蛋白酶推薦使用條件即溫度50℃左右、添加量為底物質量的0.1%～0.3%，并結合實際需求控制反應時間，以蛋白水解度為響應值，采用軟件Design Expert 10.0設計三因素三水平試驗，分別對風味蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解時間、酶解溫度以及酶添加量進行優化。因素水平及編碼見表1和表2。

表1 風味蛋白酶響應面試驗因素及水平編碼值Table 1 Factor and levels in response surface methodology of flavourzyme

表2 木瓜蛋白酶響應面試驗因素及水平編碼值Table 2 Factor and levels in response surface methodology of papain

1.3.3 氨基態氮含量及水解度測定

氨基態氮含量：參考GB/T 12143-2008《飲料通用分析方法》以及趙新淮等[13]甲醛電位滴定法。

式中：V1表示樣品加入甲醛后消耗NaOH溶液的體積，mL；V2表示空白對照組加入甲醛后消耗NaOH溶液的體積，mL；NNaOH表示NaOH溶液的濃度，mol/L。

2 結果與分析

2.1 風味蛋白酶響應面試驗結果與分析

2.1.1 回歸模型建立與顯著性檢驗

風味蛋白酶響應面中心組合試驗設計及結果見表3。試驗后利用軟件Design-Expert 10.0對上述試驗結果進行多元線性回歸分析，可建立水解度（Y）對酶解時間（A）、酶解溫度（B）和酶添加量（C）的二次回歸方程：

對試驗所建立的回歸模型進行方差分析結果見表4。P值=0.000 5＜0.01，達極顯著水平；失擬項P值=0.801 0＞0.05，不顯著，說明本試驗所建立的回歸模型擬合度較高，能夠真實的擬合響應面。相關系數R2=0.957 3，說明采用響應面法所建立的回歸模型回歸效果較好。此外，通過比較回歸方程中一次項系數絕對值的大小，可看出3個因素對風味蛋白酶酶解效果的主次順序依次為：酶解溫度（B）＞酶添加量（C）＞酶解時間（A）。

表3 風味蛋白酶響應面中心組合試驗設計及結果Table 3 Central composite design scheme and results for response surface analysis of flavourzyme

表4 風味蛋白酶響應面試驗回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis for the fitted regression equation of flavourzyme

續表4 風味蛋白酶響應面試驗回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis for the fitted regression equation of flavourzyme

2.1.2 響應曲面和等高線圖分析

3D圖可以評價各因素間的交互作用，響應面圖彎曲度越大，表明兩因素交互越顯著。等高線的形狀可以更為直觀的反應兩變量的交互作用顯著與否，等高線為橢圓形，則表示兩變量交互作用顯著[14-15]。

酶解時間與酶解溫度對水解度的影響如圖1所示，響應曲面彎曲度大，說明其兩兩之間的交互作用對水解度的影響是顯著，即在酶解時間1.8 h～2 h，酶解溫度45℃～47℃范圍內，水解度處于最大值區域；酶解溫度與酶添加量對水解度的影響如圖2所示，即酶添加量0.08%～0.09%，酶解溫度45℃～47℃范圍內，水解度處于最大值區域。從等高線橢圓曲線來看，酶解溫度和酶添加量存在更為顯著的交互作用，在酶添加量一定時，酶解溫度與水解度呈負相關關系，較低溫度時水解度隨酶添加量遞增有升高趨勢。酶解時間與酶添加量對水解度影響如圖3所示，酶解時間與酶添加量響應曲面較平緩，等高線近似呈圓形，因此它們之間對水解度影響較低。

圖1 時間、溫度對DH影響的響應面圖和等高線圖Fig.1 Response surface and contour plots for the effect of cross-interaction between hydrolysis time and temperature on DH of crab extract

圖2 溫度、酶添加量對DH影響的響應面圖和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots for the effect of cross-interaction between hydrolysis temperatureand and flavourzyme amount on DH of crab extract

圖3 時間、酶添加量對DH影響的響應面圖和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots for the effect of cross-interaction between hydrolysis time and flavourzyme amount on DH of crab extract

2.2 木瓜蛋白酶響應面試驗結果與分析

2.2.1 回歸模型建立與顯著性檢驗

木瓜蛋白酶響應面中心組合試驗設計及結果見表 5，以酶解時間（A）、酶解溫度（B）和酶添加量（C）為自變量，水解度（Y）為響應值，對木瓜蛋白酶酶解試驗結果進行多元回歸分析，所建立的回歸方程為：

對試驗所建立的回歸模型進行方差分析結果如表6所示，回歸模型回歸效果較好，能夠用于預測木瓜蛋白酶對河蟹高壓浸提液的酶解效果，3個因素對蛋白酶的酶解效果影響主次順序依次為酶添加量（C）＞酶解溫度（B）＞酶解時間（A）。

2.2.2 響應曲面和等高線圖分析

木瓜蛋白酶酶解時間與酶解溫度對水解度的影響如圖4所示，酶解時間與酶解溫度響應曲面彎度較大，表明時間與溫度對水解度影響顯著，在酶解時間一定時，隨溫度升高，水解度先升高后降低，在48℃～52℃之間達到最高值。可能是由于溫度低于48℃，蛋白酶無法充分發揮功效，高于52℃，蛋白酶失活，也符合了所用木瓜蛋白酶最適溫度為50℃左右這一設計響應面試驗的前提條件；酶解溫度與酶解時間對水解度的影響如圖5所示，酶解溫度與酶添加量響應曲面彎度最大，等高曲線呈橢圓形，表明兩者間交互作用對水解度影響極為顯著；酶解時間與酶添加量對水解度影響如圖6所示，酶解時間與酶添加量響應曲面平緩，兩者間交互作用對水解度影響較低，但在選定的范圍內，水解度與酶解時間和酶添加量均呈正相關關系。

表5 木瓜蛋白酶響應面中心組合試驗設計及結果Table 5 Central composite design scheme and results for response surface analysis of papain

表6 木瓜蛋白酶響應面試驗回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis for the fitted regression equation of papain

2.3 驗證與優化

分析回歸方程Y1，得到風味蛋白酶的最佳酶解條件為：酶解溫度47.657℃、酶解時間1.161 h、酶添加量0.084%，在此條件下預測水解度可達到10.697%，考慮到實際操作的可行性，將最佳工藝條件修整為酶解溫度為47℃、酶解時間1.2 h、酶添加量0.08%。重復試驗3次，測得水解度平均值11.08%；分析回歸方程Y2，得到木瓜蛋白酶的最佳酶解條件為：酶解溫度52.991℃、酶解時間1.649 h、酶添加量0.059%，在此條件下預測水解度可達到10.269%，同理修整工藝條件為酶解溫度為53℃、酶解時間1.6h、酶添加量0.06%，水解度平均值10.64%，實際測定值與模型預測值基本一致，可見該模型能較好地預測實際河蟹高壓浸提液酶解過程中水解度的變化。

圖4 時間、溫度對DH影響的響應面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots for the effect of cross-interaction between hydrolysis time and temperature on DH of crab extract

圖5 溫度、酶添加量對DH影響的響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of cross-interaction between hydrolysis temperature and papain amount on DH of crab extract

圖6 時間、酶添加量對DH影響的響應面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of cross-interaction between hydrolysis time and papain amount on DH of crab extract

3 結論

基于響應面優化試驗結果，得到風味蛋白酶最佳工藝條件為添加0.08%風味蛋白酶，47℃下酶解1.2 h，水解度可達11.08%；木瓜蛋白酶最佳工藝條件為0.06%木瓜蛋白酶，53℃下酶解1.6 h，水解度為10.64%，得到的蟹味香料色澤金黃，河蟹特征風味濃郁，無不良風味，可作為一類新型蟹味香料進行生產。下一步可將兩種酶結合復配使用，是否會得到更好的效果有待研究。