超臨界流體工藝萃取茶葉香氣成分

張琪，劉珺，呂玉憲，朱運華，呂虎，*

（1.江西師范大學生命科學學院，江西南昌330022；2.江西省桑蠶茶葉研究所，江西南昌330202）

香氣是茶葉最重要的品質之一，茶葉的香氣物質在茶葉產業中一直被人們所重視。在茶葉深加工過程中，茶葉的香氣物質損失影響產品的質量和風味，這一問題一直困擾著茶葉深加工產業。開發高效的萃取方法，能最大限度保留茶葉香氣物質，對提高茶葉深加工品的質量具有重要意義。目前用于茶葉香氣物質的萃取方法有同時蒸餾萃取法（simultaneous distillation extraction，SDE）、固相微萃取法（solid-phase microextraction，SPME）、減壓蒸餾萃取法（vaccum distillation extract，VDE）、頂空吸附法等。SDE可得到較多的香氣物質總量和種類[1]，但會產生一些新的揮發性衍生物[2]，所得精油有焦煳味，香氣嚴重失真[3]；SPME能夠避免茶葉中香氣組分被破壞，但提取率很低，常用于茶葉香氣成分的分析[4-5]。VDE的試樣和試劑的消耗量大且樣品處理周期長，同時該方法萃取劑大多采用有毒有害試劑，不能應用在食品加工過程。頂空吸附法雖然能極大程度的反映茶葉本身的香氣[6]，由于萃取量小，通常只用于揮發性成分的分析。國內外關于提取茶葉香氣成分的工藝制備的研究少見報道。

CO2超臨界流體萃取（supercritical fluid extraction，SFE）萃取工藝選擇性好，不僅可以極大程度保留茶葉的原香，且處理量大、萃取率高，還有無溶劑殘留以及節能環保等諸多優點。本文以茶葉浸膏萃取率為主要考察指標，以感官評定（與原茶香氣嗅味比較）為次要考察指標，采用正交試驗設計，對CO2SFE工藝條件進行了優化研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

參考NY/T 2943-2016《茶樹種質資源描述規范和數據標準》的方法，2017年4月采摘春季的l芽2葉，按茶樣提供廠家自身的生產方法制備干茶茶樣。

前嶺銀毫茶：江西省蠶桑茶葉研究所提供。CO2鋼瓶氣：南昌氮肥廠。

1.2 儀器與設備

Sartorius電子分析天平：德國 Sartorius公司；GC6890-MS5973N型氣相色譜-質譜儀：美國Agilent公司；HL-（5+1）L/50-ⅢBQ型超臨界流體萃取裝置：杭州華黎泵業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 茶葉精油的萃取

茶葉精油的萃取方法參考文獻[6]。

1.3.2 茶葉精油成分的氣相色譜-質譜分析（gas chromatography-mass spectrometric analysis，GC-MS）

通過用質譜計算機數據系統檢索及核對Nist 2005和Wiley275標準質譜圖，分析得到的總離子流色譜圖中各色譜峰的質譜信息，確定每個物質的結構。各香氣成分的相對質量分數為各色譜峰的峰面積與總峰面積的比值[6]。

1.4 茶葉精油的感官評定方法

稱取原茶試樣3.00 g，置于150 mL容量的評茶杯中，注滿沸水，加蓋，沖泡5 min后，將茶湯瀝入審評香氣；同時吸取0.5 g提取的精油樣品置于150 mL容量的評茶杯中，注滿沸水，1 min～2 min后審評香氣，并與原茶進行比較。由5位具有國家級資質的高級評茶師對提取精油與原茶樣品的香氣特色進行評分，對茶精油樣品的顯著特征進行描述。評分標準詳見國標GB/T 23776-2009《茶葉感官評審方法》[7]。

1.5 單因素試驗與正交試驗設計

首先進行單因素試驗，考察壓力（10、15、20、25、30、35 MPa）、溫度（35、40、45、50、55 ℃）、CO2流量（5、6、7、8、9 L/h）、萃取時間（1、2、3、4、5、6 h）這 4 個單因素對精油萃取率的影響。

根據單因素試驗結果，確定正交試驗因素水平，采用L9（34）正交設計安排正交試驗。

表1 正交試驗L（934）因素水平表Table 1Factors and levels of orthogonal experiment L（934）

1.6 復合萃取時間因素優化

運用SPSS19.0軟件對試驗數據進行單因素、多因素方差分析處理，確定萃取的最佳參數。

2 結果與分析

2.1 萃取壓力對茶葉精油產率的影響

50℃、CO2流量6 L/h條件下萃取1 h，不同的萃取壓力對茶葉精油產率的影響見圖1。

圖1 不同壓力對對茶葉精油產率的影響Fig.1 Effect of different pressures on extraction yield of tea essential oil

由圖1可知，隨著萃取壓力的升高，產率持續上升并逐漸趨于平緩。首先，在一定壓力范圍內，增加萃取壓力，超臨界CO2的密度隨之增大，茶葉與CO2的接觸面積增大，引起被萃取物的溶解度和傳質效率增加，其次是揮發性物質隨壓力增大而揮發性增強，這二者均有利于萃取。但壓力超過一定范圍后，超臨界CO2的密度隨著壓力的升高而增加的速率降低，且高壓對儀器設備的要求也逐漸變高。劉佳等[8]的研究結果也支持本文觀點，結合圖1，得到較佳的萃取壓力為25MPa。

2.2 萃取溫度對茶葉精油產率的影響

20 MPa、CO2流量6 L/h條件下萃取1 h，不同的萃取溫度對茶葉精油產率的影響見圖2。

圖2 不同溫度對茶葉精油產率的影響Fig.2 Effect of different temperatures on extraction yield of tea essential oil

由圖2可知，隨著溫度的升高，產率先上升后下降。溫度也是影響CO2超臨界流體萃取效率的關鍵因素之一，其影響具有兩面性。一方面，溫度的升高，增加溶劑的揮發與擴散，同時升高溫度，有助于增加分子間的締合幾率，使得傳質系數增加，促進了產率的提高；另一方面，隨著溫度繼續升高，超臨界CO2的分子間距增加，使得超臨界CO2的密度降低，減少被萃取物的溶解度，傳質效率降低，產率下降，而且過高的溫度會導致香氣物質中的損失進一步加劇。由圖2可知，溫度低于50℃時，溫度對于傳質系數的影響處于優勢，而當溫度高于50℃時，產率明顯降低。得到較佳的萃取溫度為50℃。

2.3 CO2流量對茶葉精油產率的影響

20 MPa、50℃、萃取 1 h 條件下，改變 CO2流量對茶葉精油產率的影響見圖3。

圖3 不同CO2流量對茶葉精油產率的影響Fig.3 Effect of different CO2flow rates on extraction yield of tea essential oil

隨著CO2流量的增大，產率緩慢上升并趨于平緩，整體來說影響不大。一方面，增大CO2流量，由于卷吸效應[9]，使得被萃取物與超臨界CO2充分接觸混合，提高了產率；另一方面，CO2流量的增大，被萃取物與超臨界CO2接觸時間縮減，傳質過程不充分，降低了產率[10]。由圖3可知，在CO2流量為8L/h時，其產率達到最高，可能是卷吸效應與接觸時間縮減達到平衡所致。

2.4 萃取時間對茶葉精油產率的影響

20 MPa、50℃、CO2流量 6 L/h 條件下，萃取不同時間對茶葉精油產率的影響見圖4。

圖4 不同萃取時間對茶葉精油產率的影響Fig.4 Effect of different extraction time on extraction yield of tea essential oil

由圖4可知，在最初的1 h～3 h，萃取率隨著時間增加而增加明顯，3 h后萃取率增加趨緩，4 h后萃取率未見增加。萃取時間對于產率的影響具有條件性，即其只在一定范圍內對產率有顯著影響。萃取初始階段，隨著萃取時間越長，被萃取物與超臨界CO2的接觸混合越充分，產率越高；萃取后期，被萃取物與超臨界CO2已經充分接觸混合，產率達趨于最高值，時間的延長并不等顯著增加產率，同時，萃取時間的延長，還會提高萃取的成本。圖4可得，對于茶葉精油的萃取，3 h是一個合理的萃取時間，即在控制成本的前提下盡可能多的提高產率。

2.5 正交試驗結果

根據影響CO2SFE的單因素結果，采用萃取壓力、萃取溫度、CO2流量、萃取時間4項指標，通過L9（34）正交設計，測定其組合后對茶葉精油的萃取效果。正交試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal experiment results

由表2得萃取壓力、溫度、流量、時間4個因素的極差分別為 0.27、0.21、0.10、0.79，表明時間對茶葉精油萃取的影響最大。各因素對萃取率的影響主次為：時間＞壓力＞溫度＞流量。在壓力25 MPa、溫度45℃、CO2流量8L/h、時間4h條件下，獲得精油產率為2.57%，確定為較高較佳萃取組合。

2.6 感官評定結果

在萃取壓力低于25 MPa其他因素不變時所提取的茶葉精油中，香氣淡薄不及原茶樣品香味濃郁。這可能是因為壓力主要影響萃取效率，對于茶葉風味物質各組分的比例無明顯的破壞。在萃取溫度低于45℃、其他因素不變時所提取的茶葉精油中香短香貧，與原茶樣品香氣有一定差異。但當溫度高于50℃，所提取的茶葉精油香味略陳悶，與原茶樣品香氣比較失真較明顯。這可能是其中風味峰量組分在這個溫度范圍內損失所致。其他因素相同、CO2流量低于8 L/h的條件中，流量越大，所提取的茶葉精油香氣越清長，越接近原茶樣品香氣；但當CO2流量達到9 L/h時，所提取的茶葉精油香氣較原茶樣品略有差異。我們認為在CO2流量為9 L/h時，傳質過程不充分造成溶解度不同的組分萃取程度不一致，特征香氣物質比例發生變化，造成最后的精油與原茶有差異。在3 h以內、其他條件相同，所得到茶葉精油的香氣濃郁度隨著時間的延長而增加；萃取時間超過4 h，對于精油的濃郁度無明顯影響，但是香味較原茶樣品有一定的差異[11-15]?？梢姡? h內，萃取時間主要影響萃取速率；4 h后則在風味物質的組分之間的比例上有變化，導致了對香味的影響。

萃取組合為壓力25 MPa、溫度45℃、CO2流量8 L/h、時間4 h所提取的茶葉精油，有清香高爽，香氣鮮醇，香味保留時間較長等特點，主要風味特點都有體現出來，與原茶風味一致。

純CO2SFE萃取茶葉精油成分見表3。

表3 純CO2SFE萃取茶葉精油成分Table 3 Pure CO2SFE extraction of tea essential oil ingredients

續表3 純CO2SFE萃取茶葉精油成分Table 3 Pure CO2SFE extraction of tea essential oil ingredients

續表3 純CO2SFE萃取茶葉精油成分Table 3 Pure CO2SFE extraction of tea essential oil ingredients

由表3可知，所得的香氣物質中醛類20種，酮類19種，烯烴類17種，醇類14種，烷烴類20種，雜環類4種，酯類1種，酸類1種，硫醚類1種。其中醛類組分種類最多，醇類含量比例最高占總精油量的27.29%。不同種類物質構成的特定比例可能決定茶葉特定香氣，黃海濤等[16]認為清香型綠茶茶樣的醇類物質和烯烴類物質含量高，酯類物質含量相對較低，這一結論支持本文觀點。

除了之前討論的峰量物質對茶香有巨大貢獻，在茶葉香氣物質中，一些含量不高的化合物，其香氣閾值較低，往往在低濃度下也能表現出顯著的香氣，于愛麗等[17]的研究與本文觀點一致，呈現木香、紫羅蘭香的反式-β-紫羅酮在水中的香氣閾值僅為 0.007 μg/L[15，18-19]，對茶香也有較大的香氣貢獻。在本文結果中，苯甲醇（1.023%）杏呈仁香，2，3-辛二酮（0.93%）有奶油香，苯乙醇（0.617%）呈桃香，雙戊烯（0.507%）有檸檬香味，β-紫羅蘭酮（0.403%）有紫羅蘭香，（-）-α-蓽澄茄油烯（0.394%）有蠟香，這些特征香型的組分因為本身閾值較低，所以較少的含量也對茶葉精油的香氣也有很大的作用。王力等[20]分析毛峰綠茶香氣成分，其中苯甲醇、苯乙醇、β-紫羅酮含量較少，這和本文觀點一致。

在萃取中一些些熱敏性香氣成分遇到較高溫度會造成不同程度的破壞，不能反映物質的真實香氣，本文所優化的CO2SFE萃取工藝的萃取條件，溫度為50℃，反應時間較短，避免持續加熱產生了一些氣味不理想的化合物，如在熱作用下氨基酸脫羧，同時發生還原等反應形成的物質[18]，在所得的精油中的吡咯、吡啶、呋喃等含氮化合物種類少，且總含量不足3%，據報道這些雜環化合物有較低的氣味閾值，具有焦糊味，高濃度會有刺激性氣味[19]；本研究提取的精油由于刺激物質含量少，劉盼盼等[21]認為雜環化合物與清香、花香呈顯著負相關，這一結果也支持本文觀點。而酸類化合物大多呈現不愉快的脂味、腐臭味[22]。在精油中，酸類物質僅有1種，相對含量很低（0.09%），這也使萃取精油的香氣更好呈現。

3 結論與討論

本工藝最佳萃取組合為壓力25 MPa、溫度45℃、CO2流量8 L/h、時間4 h。因為精油中主要的呈香物質占有較大的比重而且彼此之間呈現特定的比例，所以得到產物風味與原茶香味一致，且提取方式環保，萃取出的揮發性成分達到2.57%，有較高的產率，因此可以用于茶葉香氣物質的工藝制備，為茶葉深加工奠定了良好基礎。

迄今從茶葉香氣中分離鑒定出來的有超過600種揮發性化合物，其中綠茶的主要香韻有花香、清香、甜香、板栗香等[11，24]。綠茶中已分離鑒定出300余種綠茶香氣組分，包括醇類，醛類，酯類，酮類等10余種。這些化合物共同組成青、香、鮮爽的感覺[11，24]。任何一種茶葉的香氣都是所含不同芳香物質以不同比例組合的綜合表現，即使一致的茶葉香氣特征香型，其香氣組分或多或少仍存在差異，目前研究者未能確定引起茶葉香型差異的具體物質，這也是由茶葉產生香氣過程中復雜的化學反應、呈香物質種類多、含量高低與閾值等多種因素造成的[25]。

茶葉中香氣物質可分為非極性親脂性酯類、烯類和弱極性的醇、醛、酮等，加入萃取物親和強的組分，可提高萃取的選擇性和溶解性。黃長修等[26]在萃取鐵觀音香氣物質中使用乙醇作為夾帶劑，僅萃取出33種成分。選擇夾帶劑可萃取非極性以及極性香氣物質，但夾帶劑添加量把握不當會將多余的雜質萃取出來，可能影響萃取效率，且夾帶劑的去除過程勢必引起香氣成分的損失。因此，夾帶劑的選擇以及配比還有待考究。