獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中色澤變化因素的相關(guān)性研究

張?chǎng)?，郭雨婷，孫時(shí)光，何頌捷，秦世蓉，左勇

（四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000）

獼猴桃（Actinidia chinensis Planch）屬獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia），又名奇異果、中國(guó)醋梨、羊桃等，為漿果類(lèi)落葉藤本植物，在世界上多個(gè)國(guó)家均有種植[1]。獼猴桃果實(shí)富含多種氨基酸、礦物質(zhì)、有機(jī)酸和VC等，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，有著“VC之王”的美稱[2-3]。目前，獼猴桃在我國(guó)的種植面積較大，產(chǎn)量較高且產(chǎn)地過(guò)于集中，容易出現(xiàn)鮮果銷(xiāo)售不及時(shí)而腐爛浪費(fèi)的現(xiàn)象[4]。因此，對(duì)獼猴桃的精深加工成為了目前急需解決的課題。獼猴桃果酒是以獼猴桃果實(shí)為原料，通過(guò)發(fā)酵釀制而成的一種低度果酒，因其口感獨(dú)特、香氣怡人、營(yíng)養(yǎng)豐富而受到廣大消費(fèi)者的青睞。

果酒的色澤是產(chǎn)品重要的感官指標(biāo)之一，會(huì)影響消費(fèi)者對(duì)產(chǎn)品的接受程度。獼猴桃是少數(shù)幾種成熟后依然呈鮮綠色的水果之一，這種鮮綠色主要來(lái)源其果實(shí)中富含的葉綠素。但是在獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中，獼猴桃固有的鮮綠色在遭到了破壞的同時(shí)，生成許多褐色或黑色物質(zhì)，使獼猴桃果酒呈現(xiàn)黃褐色，嚴(yán)重影響果酒品質(zhì)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于獼猴桃酒的研究主要集中在釀造工藝的優(yōu)化和香氣成分的分析，對(duì)于獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中色澤變化的研究尚不多見(jiàn)[5-8]。試驗(yàn)通過(guò)監(jiān)測(cè)獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中色澤、多酚氧化酶、過(guò)氧化物酶、葉綠素、總酚、黃酮、VC等物質(zhì)的變化情況，結(jié)合統(tǒng)計(jì)分析，探究其影響色澤的主要因素，為進(jìn)一步控制獼猴桃果酒的色澤變化提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠心獼猴桃、白砂糖：市售；活性干酵母：湖北安琪酵母公司；果膠酶（5萬(wàn)U/g）：寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；鄰苯二酚（分析純）：上海阿拉丁試劑有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（99%）：上海國(guó)藥集團(tuán)；葡萄糖、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、重鉻酸鉀、福林酚、焦性沒(méi)食子酸、無(wú)水碳酸鈉、愈創(chuàng)木酚、抗壞血酸、硫酸、硫酸銅（均為分析純）：成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

GZ-250-HS恒溫恒濕培養(yǎng)箱：韶關(guān)廣智科技設(shè)備公司；TG-16醫(yī)用離心機(jī)：上海安信有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海普析通用儀器有限公司；UltraScan VIS臺(tái)式色差儀：美國(guó)HunterLab有限公司；JYZ-E3榨汁機(jī)：山東九陽(yáng)小家電公司。

1.3 方法

1.3.1 獼猴桃果酒釀造

獼猴桃鮮果→挑選→清洗→打漿（加入SO2）→酶解→接種酵母→前發(fā)酵→倒罐→后發(fā)酵→陳釀→降酸→過(guò)濾→調(diào)配→密封裝瓶→果酒成品

1.3.2 主要操作要點(diǎn)

1）獼猴桃的前處理、打漿、酶解：選擇八成熟無(wú)病蟲(chóng)且飽滿完整的獼猴桃果，用清水沖洗后加入SO2打漿，向果漿中加入果膠酶，酶解期間每隔2 h攪拌一次。

2）前發(fā)酵：用蔗糖將果汁總糖調(diào)節(jié)至200 g/L后接種酵母，酵母接種比例為0.2 g/L，接種前活化；發(fā)酵溫度在（20±2）℃內(nèi)。

3）后發(fā)酵：前發(fā)酵結(jié)束后倒罐，將果酒倒出，封罐后進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度控制在（16±1）℃，直至總糖含量低于4 g/L，過(guò)濾后在20℃環(huán)境下陳釀[4]。

在發(fā)酵過(guò)程中前發(fā)酵期間（0～10 d）每隔24 h取樣，后發(fā)酵期間（10 d～20 d）每隔48 h取樣分析。

1.3.3 色度測(cè)定

以透射模式 10°觀察模式測(cè)定樣品 L*、a*、b*值；其中L*表示亮度值（0為黑色，100為白色），a*值表示綠紅值（a*＞0為紅色，a*＜0 為綠色），b*表示藍(lán)黃值（b*＞0為黃色，b*＜0為藍(lán)色）；用 dE（色差值）描述樣品的顏色變化，計(jì)算公式如下[9]：

1.3.4 葉綠素含量的測(cè)定

葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素的含量：紫外分光光度法[10]。

1.3.5 多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性的測(cè)定

3 mL反應(yīng)體系中，包括0.1 mol/L的鄰苯二酚1 mL，pH6.5的磷酸緩沖液1.9 mL和0.1 mL獼猴桃酒樣。將其置于410 nm波長(zhǎng)下，從獼猴桃果酒加入開(kāi)始計(jì)時(shí)，每30 s記錄一次OD410值以最初直線段的斜率計(jì)算酶活力，表示為A410。

1.3.6 過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）活性的測(cè)定

1）反應(yīng)液制備：在 100 mL，pH6.0、0.1 mol/L 磷酸緩沖溶液中，加入0.5 mL愈創(chuàng)木酚和1 mL體積分?jǐn)?shù)為 30%的 H2O2。

2）測(cè)定：試管中加入3 mL反應(yīng)液和0.1 mL獼猴桃酒樣，立即搖勻并迅速倒入比色皿中，于470 nm波長(zhǎng)下記錄吸光度的變化值，每30 s記錄一次，共記錄3 min，即A470。以不添加任何酶液的反應(yīng)體系為對(duì)照。以A470值表示過(guò)氧化物POD的酶活性。

1.3.7 總酚含量的測(cè)定

Folin-酚法，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=1.327 1x+0.014 5，相關(guān)系數(shù) R2=0.999 3。

1.3.8 黃酮含量的測(cè)定[11]

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度高于99%）在110℃溫度下干燥至恒重，準(zhǔn)確稱取50.00 mg，用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中并用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液定容至刻度，即500 mg/L蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。取5支50 mL容量瓶分別加入1、2、3、5、10 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2溶液1mL，混勻后靜置6 min；然后分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Al（NO3）3溶液1 mL，混勻后靜置6 min；隨后分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的NaOH溶液10 mL；最后用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液定容至50 mL，混勻后靜置12 min后在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，以蘆丁含量（x）為橫坐標(biāo)，吸光度（y）為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.082 1x-0.003 9，相關(guān)系數(shù) R2=0.999 2。

2）樣品測(cè)定：用移液管準(zhǔn)確移取3份過(guò)濾好的獼猴桃酒樣5 mL，于50 mL容量瓶中，分別加入5 mL蒸餾水以稀釋酒樣。第一份直接用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液定容至50 mL，以作對(duì)照。其他兩份然后分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%NaNO2的溶液1 mL，混勻后靜置6 min；然后分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%Al（NO3）3的溶液1 mL，混勻后靜置6 min；隨后分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的NaOH溶液10 mL；最后用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液定容至50 mL，混勻后靜置12 min后在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，并根據(jù)上述的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算出獼猴桃酒樣中的總黃酮含量。

1.3.9 VC測(cè)定

參照王海佳的方法[12]。

1.3.10 5-羥甲基糠醛 （5-hydroxymethylfurfural，5-HMF）含量的測(cè)定

5-HMF含量的測(cè)定參考薛楚然的方法[13]，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.106 8x+0.038，相關(guān)系數(shù)R2=0.997。

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)與結(jié)果處理

每組試驗(yàn)做3次平行，試驗(yàn)結(jié)果均以x±sd表示。采用Origin 2018軟件繪制圖表，SPSS 20軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中色度變化情況

對(duì)于獼猴桃果酒，其色澤是衡量產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)，將直接影響消費(fèi)者的接受度。獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中色度變化見(jiàn)圖1。

圖1 獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中色度的變化Fig.1 Changes in chroma during the fermentation of kiwi wine

如圖1所示，獼猴桃果酒的色澤變化主要發(fā)生在主發(fā)酵階段（0～10 d）：色差值dE從0上升到了47.05；其中a*值代表了獼猴桃果酒的紅綠色調(diào)（a*＞0紅色色調(diào)、a*＜0 代表綠色），a*值從-7.3 上升到了-1.55，這說(shuō)明獼猴桃果汁固有的鮮綠色遭到了極大的破壞；b*值代表了黃藍(lán)色調(diào)（b*＞0黃色色調(diào)、b*＜0藍(lán)色色調(diào)），呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在第4天達(dá)到了最高值，從45.58下降到了21.09，說(shuō)明在發(fā)酵過(guò)程中也引起了果肉黃色的顯著損失。在后發(fā)酵階段（10 d～20 d），獼猴桃果酒的色澤進(jìn)一步發(fā)生變化：dE從47.05上升到了57.68；a*從-1.55上升到了-0.03，果酒綠色色調(diào)基本消失；b*從21.09下降到了13.67，果酒酒體由淡黃色呈現(xiàn)為黃褐色。

2.2 獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中葉綠素含量變化情況

葉綠素是獼猴桃及其制品的主要呈色物質(zhì)，綠色值（-a*）是評(píng)價(jià)果漿綠色的感官指標(biāo)，在獼猴桃果漿加工中要綜合考慮葉綠素含量和綠色的保留[14-16]，獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中葉綠素含量變化見(jiàn)圖2。

圖2 獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中葉綠素含量的變化Fig.2 Changes of chlorophyll content during the fermentation of kiwi wine

由圖2可以看出，在獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中，葉綠素一直處于下降的趨勢(shì)，其中在主發(fā)酵階段葉綠素的含量迅速下降，與獼猴桃果酒的色澤中a*值的變化呈負(fù)相關(guān)。其原因在于，葉綠素的性質(zhì)極不穩(wěn)定，容易受到外界條件如光、溫度和酸性物質(zhì)等的干擾而發(fā)生降解；另外由于獼猴桃本身屬于酸性物質(zhì)，在果漿破碎后大量的空氣進(jìn)入漿果中也引起了葉綠素氧化而被降解，導(dǎo)致果酒原本的鮮綠色消失。因此，在獼猴桃果酒的發(fā)酵過(guò)程中，應(yīng)在保證產(chǎn)品品質(zhì)的基礎(chǔ)上，控制合適的發(fā)酵條件（如溫度、光照、pH值等），盡量減少其色素的降解。

2.3 獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中多酚氧化酶活性變化情況

由于多酚氧化酶能夠在氧參與的情況下把多酚類(lèi)物質(zhì)氧化成對(duì)應(yīng)的醌類(lèi)物質(zhì)，醌類(lèi)物質(zhì)會(huì)進(jìn)一步聚合形成黑色素，影響果酒色澤和品質(zhì)，獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中多酚氧化酶活性變化見(jiàn)圖3。

圖3 獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中多酚氧化酶活性的變化Fig.3 Changes in polyphenol oxidase activity during the fermentation of kiwi wine

從圖3可以看出，多酚氧化酶的活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在獼猴桃果酒發(fā)酵的前兩天，由于獼猴桃果汁破碎處理后，細(xì)胞遭到破壞，細(xì)胞內(nèi)的多酚氧化酶釋放并與底物和氧氣充分接觸，使其活性升高。隨著酒精發(fā)酵過(guò)程的開(kāi)始，氧氣被進(jìn)一步消耗，與此同時(shí)生成的CO2將果酒中的氧氣排出，使得多酚氧化酶的活性被逐漸抑制。倒罐后，由于再次添加了亞硫酸鉀，游離出的SO2進(jìn)一步抑制了多酚氧化酶的活性，因此在后發(fā)酵后期，多酚氧化酶的活性會(huì)逐步趨于穩(wěn)定[9]。

2.4 獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中過(guò)氧化物酶活性變化情況

過(guò)氧化物酶能夠與多酚氧化酶一起催化多酚類(lèi)物質(zhì)，導(dǎo)致其生成醌類(lèi)物質(zhì)進(jìn)一步聚合形成黑色素。此外，過(guò)氧化物酶也可以參與VC的氧化反應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)褐變。獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中過(guò)氧化物酶活性含量變化見(jiàn)圖4。

圖4 獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中過(guò)氧化物酶活性的變化Fig.4 Changes in peroxidase activity during the fermentation of kiwi wine

如圖4所示，過(guò)氧化物酶活性的變化與多酚氧化酶活性變化基本相似，總體處于先升高后降低的趨勢(shì)。過(guò)氧化物酶的活性在第3天達(dá)到最高值，此后其活性迅速下降；進(jìn)入后發(fā)酵階段，過(guò)氧化物酶的活性逐漸趨于穩(wěn)定。倒罐后添加的SO2同樣會(huì)限制過(guò)氧化物酶的活性，使其在后發(fā)酵階段逐漸趨于穩(wěn)定。

2.5 獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中總酚和黃酮含量變化情況

在獼猴桃果酒的發(fā)酵過(guò)程中，獼猴桃皮渣在獼猴桃汁中不斷浸漬，逐漸釋放單寧等多酚類(lèi)物質(zhì)及黃酮。獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中總酚和黃酮含量變化見(jiàn)圖5。

如圖5所示，總酚和黃酮含量在獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中呈現(xiàn)先上升后逐漸下降的趨勢(shì)。在發(fā)酵的前6 d，總酚和黃酮含量快速上升，增幅分別達(dá)到40%和248%，此后，直到發(fā)酵結(jié)束，總酚含量逐漸降低，較發(fā)酵開(kāi)始時(shí)下降了約10%，黃酮含量較發(fā)酵開(kāi)始時(shí)上升了8%。原因在于，在發(fā)酵前期，獼猴桃皮渣中的多酚和黃酮類(lèi)物質(zhì)迅速浸出并溶入發(fā)酵醪中，使發(fā)酵液中的總酚和黃酮含量升高；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液中酚類(lèi)與黃酮類(lèi)物質(zhì)逐漸趨于平衡，含量呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)；伴隨著發(fā)酵醪中的皮渣分離后，酚類(lèi)與黃酮類(lèi)物質(zhì)被氧化分解，使總酚和黃酮含量進(jìn)一步下降，這與王行等的研究結(jié)果一致[17]。

圖5 獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中總酚和黃酮含量的變化Fig.5 Changes in total phenolic and flavonoid content during the fermentation of kiwi wine

2.6 獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中VC含量變化情況

獼猴桃果實(shí)中富含豐富的VC，是其鮮果營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的重要原因之一，此外VC也常常作為添加劑與檸檬酸配合用來(lái)抑制酶促褐變，但添加使用不當(dāng)，抗壞血酸的氧化褐變反過(guò)來(lái)又會(huì)影響產(chǎn)品的色澤。獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中VC含量變化見(jiàn)圖6。

圖6 獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中抗壞血酸含量的變化Fig.6 Change of ascorbic acid content during the fermentation of kiwi wine

從圖6可以看出，發(fā)酵階段開(kāi)始后VC含量一直處于下降的趨勢(shì)，由發(fā)酵開(kāi)始時(shí)的444 mg/L下降到了368 mg/L。在獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中，VC的降解途徑主要分為有氧降解和無(wú)氧降解：有氧降解過(guò)程中，VC被氧化成為脫氫抗壞血酸，與氧氣進(jìn)一步結(jié)合后被氧化成二酮基古洛糖酸，二酮基古洛糖酸脫羥基后成為羥基糠醛；無(wú)氧降解過(guò)程中，脫氫抗壞血酸在CO2的作用下形成糠醛物質(zhì)[18-19]，羥基糠醛可聚合成為褐色物質(zhì)影響果酒色澤。

2.7 獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中5-羥甲基糠醛（5-HMF）含量變化情況

美拉德反應(yīng)、抗壞血酸氧化分解、焦糖化反應(yīng)和多元酚氧化縮合反應(yīng)4種反應(yīng)都會(huì)形成一種共同的中間產(chǎn)物—羥甲基糠醛（HMF），因此，通常將5-HMF作為評(píng)價(jià)產(chǎn)品非酶褐變及程度的指標(biāo)。獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中5-羥甲基糠醛（5-HMF）含量變化見(jiàn)圖7。

圖7 獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中5-HMF含量的變化Fig.7 Changes of 5-HMF content during the fermentation of kiwi wine

如圖7所示，在主發(fā)酵階段，5-HMF含量的變化十分顯著，在發(fā)酵前兩天，5-HMF含量從最初的0.6 μg/mL迅速上升達(dá)到1.91 μg/mL，然后其含量迅速下降，在第7天含量為0.65 μg/mL，與發(fā)酵開(kāi)始時(shí)含量相差不大。進(jìn)入后發(fā)酵階段，5-HMF的含量呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)，至發(fā)酵結(jié)束其含量為0.34 μg/mL。分析其原因認(rèn)為是，發(fā)酵前期由于美拉德反應(yīng)后階段的縮合反應(yīng)速率較慢，生成的5-HMF主要用于積累，故表現(xiàn)為增加趨勢(shì)；到了發(fā)酵后期，果糖與葡萄糖參與美拉德反應(yīng)速率變慢，使5-HMF生成量減少，5-HMF的消耗速率大于積累速率，含量因此不斷減少。

2.8 獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中褐變因素與色度（dE*）相關(guān)性分析

利用SPSS 20軟件，將研究中測(cè)定的各項(xiàng)指標(biāo)與色度進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中褐變因素與色度（dE）相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of browning and browning degree（dE）in kiwi wine fermentation

由表1可以看出，在獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中，與色度（dE）呈極顯著相關(guān)的因素分別是葉綠素、多酚氧化酶（PPO）、抗壞血酸、過(guò)氧化物酶（POD）和總酚。相關(guān)性分析的結(jié)果表明，多酚氧化酶（PPO）和葉綠素對(duì)獼猴桃果酒發(fā)酵過(guò)程中色澤變化影響最大，其次是抗壞血酸、POD、總酚，5-HMF和黃酮對(duì)獼猴桃果酒的色澤變化影響較小。

3 結(jié)論

獼猴桃果酒在發(fā)酵過(guò)程中，其色澤由最初的鮮綠色變?yōu)辄S綠色再轉(zhuǎn)變?yōu)辄S褐色，其色澤變化情況十分嚴(yán)重；色差值與葉綠素和PPO呈極顯著相關(guān)（p＜0.01），其相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到-0.941和-0.902，這說(shuō)明引起獼猴桃果酒色澤變化的主要因素是色素的降解和酶促褐變。色差值與抗壞血酸、POD和總酚含量也呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)性極顯著（p＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為-0.856、-0.809和-0.749，說(shuō)明引起獼猴桃果酒色澤變化的次要因素是抗壞血酸反應(yīng)與非酶促褐變。

對(duì)于獼猴桃果酒的護(hù)色應(yīng)該主要圍繞其葉綠素的特性來(lái)優(yōu)化發(fā)酵工藝，以及添加適當(dāng)?shù)碾x子抑制劑使葉綠素形成穩(wěn)定的螯合物。此外，針對(duì)獼猴桃果酒容易發(fā)生的酶促褐變可以采用添加酶活性抑制劑來(lái)實(shí)現(xiàn)酶促褐變的控制。