響應面法優化雙孢菇鮮味物質提取工藝的研究

盧朝婷，劉江，王曉君，沈秋霞，劉洪,*，李明元，吉禮

（1.西華大學食品與生物工程學院，四川成都610039；2.四川省食品生產安全協會，四川成都610061）

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）又稱白蘑菇、洋蘑菇，是天然的綠色食品原料，具有藥用價值高和營養豐富等特點，為當今最廣泛、產量最大、消費量最高的食用菌之一。近幾年來，我國蘑菇栽培發展迅速，產量和出口量超越美國躍居世界第一，是我國近年來出口量最大的食用菌之一[1]。其氨基酸組成全面，并含有人體所需的8種必需氨基酸[2]，尤其是含有豐盛的呈鮮核苷酸（如：肌苷酸、鳥苷酸、胞苷酸等）和呈味氨基酸（如：谷氨酸、天冬氨酸等），不僅富含營養物質，而且還有特殊的菇味，具有“素中之王”的稱號。雙孢菇營養豐富，肉質肥厚，味道鮮美，且熱能低，是高蛋白質、低脂肪食品[3]。我國是雙孢菇生產大國，雙孢菇含有豐富的營養，具有醫療保健作用，氣味獨特味道鮮美，深得消費者喜愛，國內消費逐年增加。但由于采摘后雙孢蘑菇中的多酚物質易發生褐變，使雙孢蘑菇風味變壞，失去商業價值，阻礙了雙孢蘑菇深加工的發展[4]。目前，國內外對雙孢蘑菇的探討研究只在雙孢菇的采后生理、貯藏保鮮及活性物質提取等方面，市面上雙孢蘑菇加工大多是干制、罐藏、鹽制等技術，產品質量參差不齊且較單一，產業鏈短，深加工產品不足，因此，市場急需開發新型的雙孢蘑菇深加工產品類型來滿足需求，提高雙孢菇利用率和質量，促進其產業的發展[5]。

氨基酸是非常重要的呈味呈鮮物質，其中，呈鮮氨基酸在金針菇等食用菌中的含量超過氨基酸總量的40%，而谷氨酸則是重要的呈味氨基酸，其與食鹽共用鮮味明顯[6]。雙孢菇中含有非常豐富的呈味氨基酸，其中的谷氨酸、天冬氨酸、胞苷酸以及鳥苷酸等核苷酸均具有較強的呈鮮效果[7]。通過將這些具有鮮味的成分作為鮮味劑應用于調味品中，對于延長雙孢菇產業鏈，豐富雙孢菇市場具有積極作用[8]。本研究以雙孢菇為原料，利用纖維素酶來提取雙孢菇中的鮮味物質，并結合響應面法，應用Box-Behnken試驗設計的原理，以α-氨基氮含量為主要考核指標，對雙孢菇中鮮味物質的提取工藝進行優化，為更好的開發雙孢菇產品提供參考，豐富食用菌市場，為雙孢蘑菇的深加工和綜合利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢蘑菇子實體：市售，選取外形完整、無褐變、已干燥的雙孢菇備用；纖維素酶（5萬U/g）：和氏璧生物有限公司；β-環糊精：郁南縣永光環狀糊精有限公司；營養瓊脂、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）：北京奧博生物技藝有限公司；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FB124型電子分析天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；XT-100L型多功能粉碎機：水康市紅太陽電機有限公司；DK-98-ⅡA型電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；PHS-320型多功能酸度計：成都世紀方舟科技有限公司；WFJ2000紫外可見分光光度計：江蘇金壇市金城國勝試驗儀器廠；RE-52AA抽真空蒸發器、電熱式XFH不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海亞榮生化儀器廠；EYELA超微噴霧干燥儀：瑞士BUCHI公司；SH420型石墨消解儀、K1100型全自動凱氏定氮儀器：山東海能科學儀器有限公司；HXGZXA4恒溫干燥箱：浙江光合力通世紀有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 制備工藝

雙孢蘑菇→除雜→粉碎→酶解→過濾→濃縮→噴霧干燥→雙孢蘑菇粉狀鮮味料

1.3.2 雙孢菇的預處理

將購買的外形完整、無褐變、已干燥的雙孢菇，經粉碎機粉碎后過60目篩，菇粉備用。

1.3.3 雙孢菇的水解

取一定量粉碎后的雙孢蘑菇，加入一定水浸泡，混合均勻，加入一定量的纖維素酶，調節pH值，放入恒溫水浴鍋中振蕩酶解一段時間。酶解結束后，在沸水浴中滅酶10 min后，4 000 r/min離心10 min，取上清液，即得雙孢菇水解液[9-10]。

1.3.4 α-氨基氮含量的測定——茚三酮比色法[11]

在堿性溶液中氨基酸（除脯氨酸外）能與茚三酮反應生成藍紫色化合物，用吸光光度法可測定。藍紫色化合物的顏色深淺與甘氨基酸含量成正比，最大吸收波長為570 nm，故以此能夠測定樣品中氨基酸的含量。

標準曲線的繪制：分別取1 μg/mL氨基酸標準溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 于 7 個 25 mL 容量瓶中，各加水補充至容積為1.2 mL，然后加pH5.4乙酸-乙酸鈉緩沖液和茚三酮（質量分數為2%）各1.0 mL，加抗壞血酸溶液0.1 mL，混合均勻，在沸水浴中加熱15 min，取出用冷水快速冷卻至室溫，定容，搖勻，靜置15 min，在570 nm波長下，以空白試劑為參比測定各溶液吸光度A，以氨基酸質量濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線。

式中：m為標準曲線上查得氨基氮質量，μg；m1為測定樣品的質量，g。

1.3.5 蛋白質的測定

蛋白質的測定參照GB 5009.5《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》[12]第一法凱氏定氮法進行測定。

1.3.6 單因素試驗及設計方案

對加酶量、酶解pH值、酶解溫度和酶解時間4個單因素分別進行單因素試驗，每個因素取6個梯度，每個梯度各做3個平行處理，并對其α-氨基氮含量及蛋白質含量進行測定，結果取平均值，各因素變量的梯度水平見表1。

表1 各單因素變量的梯度水平Table 1 Gradient levels of each single factor variable

1.3.7 響應面設計

根據單因素試驗的結果，選取加酶量、酶解溫度和酶解時間這3個對雙孢菇香味物質影響較顯著的單因素為自變量，以α-氨基氮含量為響應值進行響應面試驗設計，研究在各單因素共同作用下的最佳工藝參數，試驗因素水平及編碼見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 2 Box-Behnken experimental design factors and levels

1.3.8 雙孢菇風味料產品分析

雙孢蘑菇風味料是一種具有豐富營養價值的調味料，具有菇類風味、速溶等特點，參照SB/T 10484《菇精調味料》[13]和 SB/T 10371《雞精調味料》[14]對產品進行分析。

2 結果與分析

2.1 α-氨基氮標準曲線的繪制

以甘氨酸標準液的質量（μg）為橫坐標，A570nm處的吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。如圖1所示，得到的標準曲線回歸方程為Y=1.211 5 X+0.006 1，相關系數為0.999 1。

圖1 α-氨基氮標準曲線Fig.1 Standard curve of α-amino nitrogen

2.2 單因素試驗

2.2.1 不同加酶量對鮮味物質提取的影響

加酶量對鮮味物質提取的影響見圖2。

圖2 加酶量對鮮味物質提取的影響Fig.2 The effect of enzyme addition on flavor extraction

由圖2可知：隨著纖維素酶添加量的增加，α-氨基氮含量先急速增加再趨于平緩，在1 000 U/g后趨于平穩，繼續添加酶量對α-氨基氮含量影響不大。蛋白質含量逐漸增加，并隨著加酶量加大后，蛋白質含量上升緩慢。這可能是加酶量在低水平時，酶濃度偏低，因此酶可以與底物充分結合，所以α-氨基氮和蛋白質均上升，隨著加酶量的不斷增加，底物已經與酶結合，多余的酶無法與底物充分結合，因此導致酶的作用受到抑制[15]。當加酶量在1 000 U/g后α-氨基氮含量趨于平穩，繼續添加酶量對α-氨基氮含量影響不大。因此從節約成本和實際考慮，選擇較佳酶量為1 000 U/g。

2.2.2 不同溫度下纖維素酶的酶解效果的影響

溫度對鮮味物質提取的影響見圖3。

圖3 酶解溫度對鮮味物質提取的影響Fig.3 Effect of digesting temperature on flavor extraction

由圖3可知：隨著酶解溫度的增加，α-氨基氮含量和蛋白質含量均呈現先逐漸上升再下降的趨勢，α-氨基氮含量在55℃達到最大。這可能是因為溫度對酶活性影響較大，在溫度低于酶的最適溫度時，隨著溫度的上升其酶活性不斷增強，因此其對細胞壁的破損能力增強，并在最適溫度時活力最大，隨著溫度的不斷增加，當其超過最佳酶解溫度時，隨著溫度的升高，其活力逐漸下降[16]，因此酶解溫度過低或過高都會抑制酶的活力，導致酶解效果不好，因此纖維素酶的較佳酶解溫度為55℃。

2.2.3 不同酶解pH值對纖維素酶的酶解影響

pH值對鮮味物質提取的影響見圖4。

圖4 酶解pH值對鮮味物質提取的影響Fig.4 Effect of enzymolysis pH value on flavor extraction

由圖4可知：隨著pH值的升高，蛋白質含量均隨著pH值的增加而增加，α-氨基氮含量隨著pH值的升高，先升高后逐漸下降，pH值繼續增大，α-氨基氮含量下降趨于平穩。這有可能是pH值過高或過低影響了酶的構象，降低了酶解效率，故選pH5.5為較佳初始pH值。

2.2.4 不同酶解時間下對纖維素酶的酶解影響

酶解時間對鮮味物質提取的影響見圖5。

圖5 酶解時間對鮮味物質提取的影響Fig.5 Effect of enzymolysis time on flavor extraction

由圖5可知：隨著酶解時間的增長，α-氨基氮含量和蛋白質含量在上升，當酶解時間超過120 min時，α-氨基氮含量開始下降。這可能是隨著酶解時間的延長，反應混合物中溶解性肽慢慢增加、底物濃度變小，這些反應產物與未水解的雙孢蘑菇粉對酶產生競爭性結合。由于酶解時間的延長會增加試驗的成本，故選擇最佳酶解時間為120 min。

2.3 響應面優化工藝

在單因素試驗的基礎上，選擇A加酶量、B酶解時間、C酶解溫度3個因素所確定的水平范圍，利用Design-expert軟件進行響應面試驗設計。根據Box-Benhnken的設計原理，以α-氨基氮含量為響應值，進行三因素三水平共17組試驗的響應面分析，結果如表3所示。

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Experimental design and results for response surface analys

2.4 纖維素酶響應面方差分析

2.4.1 以α-氨基氮含量為響應值的方差分析

纖維素酶響應面方差分析結果見表4。

由表4可知，對α-氨基氮含量所建立的二次多項回歸模型具有高度的顯著性（P=0.000 4＜0.01），失項P=0.508 0＞0.05，表示水平不顯著，說明試驗有極小的概率受到受到未知因素干擾，即模型符合要求；模型的調整確定系數R2=0.961 1說明回歸方程對試驗擬合較好，回歸效果好，可以用此模型對α-氨基氮含量進行分析和預測。通過比較各項F值，研究各因子對纖維素酶酶解雙孢蘑菇的影響，確定各因子影響到主次關系，即B（酶解時間）＞C（酶解溫度）＞A（加酶量）。

2.4.2 以α-氨基氮含量為響應值的擬合模型

以α-氨基氮含量為響應值，對纖維素酶酶解雙孢蘑菇試驗進行二次多元回歸擬合，對數據進行多元回歸分析，得到回歸方程：

表4 纖維素酶響應面方差分析結果Table 4 The cellulose variance analysis of RSM

2.4.3 以α-氨基氮含量為響應值的響應面圖分析

響應面模型是A、B、C各試驗因子所構成的三維空間曲面圖，從響應面分析圖上能夠看出纖維素酶加酶量、酶解時間、酶解溫度任意一變量取零水平時，其余兩個變量對雙孢蘑菇α-氨基氮含量的影響見圖6。

從圖6可以看出，α-氨基氮含量隨各兩因素的增加均是呈現先上升后緩慢下降的趨勢。等高線的形狀為橢圓形，則表示兩因素的交互作用強；等高線的形狀為圓形時，則表示兩因素的交互作用弱[17]。從圖6可以看出，不論是加酶量和酶解時間、加酶量和酶解溫度以及酶解時間和酶解溫度之間交互作用的等高線均為橢圓形，這就說明各兩因素之間的交互作用顯著。從其三維空間曲面圖可以看出，加酶量、酶解時間和酶解溫度兩兩交互時，對α-氨基氮含量的影響均呈現拋物線形狀，即隨著加酶量、酶解時間和酶解溫度的升高，α-氨基氮含量先增加后降低，因此，在酶解時，適當的增加加酶量、酶解溫度，延長酶解時間可以提高α-氨基氮的含量。

2.5 優化驗證試驗的結果及分析

圖6 不同因素對雙孢菇α-氨基氮含量影響的響應曲面和等高線Fig.6 Response surface and contour of different factors affecting α-amino nitrogen content of Agaricus bisporus

為精確的計算纖維素酶的最佳酶解條件，利用回歸方程對各自變量（A、B、C）求極值，得到極值點為0.63、0.41、C=0.05，即纖維素酶加酶量 1 257.04 U/g、酶解時間110.09 min、酶解溫度50.2℃，此條件下α-氨基氮含量為28.085 5 mg/g，得到纖維素酶酶解雙孢蘑菇的最優工藝參數。結合實際，調整各因素為：加酶量1 000 U/g、酶解時間110 min、酶解溫度50℃。此條件下進行3次平行試驗驗證，結果如表5所示，α-氨基氮含量為27.94 mg/g，與預測值相差為0.5%，證明了該模型的可靠性。

表5 纖維素酶最佳工藝試驗表Table 5 The best process test of cellulose

2.6 指標測定

2.6.1 感官指標

色澤：淺灰黃色。

香氣：有食用菌特殊的芳香氣味，無不良氣味和異味。

滋味：鮮美滋味，口感柔和，口味適中，無刺激性。

形態：粉狀，無霉變和結塊。

2.6.2 理化指標

雙孢蘑菇粉狀調味料的理化指標如表6所示。

表6 理化指標Table 6 The index of physics and chemistry

2.6.3 衛生指標

雙孢蘑菇粉狀調味料的衛生指標如表7所示。

表7 衛生指標Table 7 The index of microbiological

3 結論

試驗結果表明，通過單因素試驗可以得出，當其他條件相同的情況時，每個單因素對雙孢菇香味物質提取的影響情況以及最佳值，結果顯示，在單因素試驗中，選擇最佳加酶量為1 000 U/g、最佳酶解pH值為5.5、酶解最佳溫度為50℃、最佳酶解時間為120 min。在單因素試驗的基礎上，設計響應面優化試驗對雙孢菇酶解工藝進行優化，最終得到最佳組合工藝條件為纖維素酶加酶量1 257.04 U/g、酶解時間110.09 min、酶解溫度50.2℃，結合實際，調整各因素為：加酶量1 000 U/g、酶解時間110 min、酶解溫度50℃，此條件下α-氨基氮含量為27.94 mg/g，與預測值基本相符。