響應面法優化醬油蛋白質利用率的發酵條件

（四川工商職業技術學院酒類與食品工程系，四川都江堰611830）

醬油是我國傳統的釀造調味品，營養豐富且風味獨特，含有多種氨基酸、有機化合物和礦物質[1]。長期以來，釀造醬油是以大豆或者豆粕等植物蛋白為主要原料，以淀粉質原料為輔料，經米曲霉制曲、發酵釀制而成[2]，根據釀造工藝主要分為高鹽稀態發酵法和低鹽固態發酵法[3]。高鹽稀態發酵法工藝周期長，設備利用率低，投資大，產品成本高[4]，相反低鹽固態發酵法因其周期短，原料價格低廉而被廣泛用于醬油發酵。響應面分析是Box及其合作者于20世紀50年代創立的一種計算最佳試驗條件的方法，通過對各因子與結果之間的關系進行函數化，可分析出各因子之間及與結果的相互影響，得出最優條件[5]。

國內醬油生產還存在原料利用率低、浪費嚴重的問題[6]，因此本研究以非轉基因大豆為蛋白質原料，采用低鹽固態發酵工藝，利用響應面分析法分析，旨在優化低鹽固態發酵條件，提高原料利用率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

非轉基因大豆：市售；米曲霉CICC 2016、黑曲霉CICC 2039：中國工業微生物菌種保藏管理中心。

SKD-1000凱氏定氮儀：上海沛歐分析儀器有限公司；HH-1恒溫水浴鍋：常州萬合儀器制造有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程[7]

原料→潤水→蒸煮→冷卻→接種→制曲→發酵→淋油→成品

1.2.2 蛋白質利用率測定

參照GB 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》[8]，利用凱氏定氮儀測定原料中蛋白質含量以及不同條件下醬油中蛋白質含量，即可計算出蛋白質利用率，公式如下：

蛋白質利用率/%=醬油蛋白質總量/原料蛋白質總量×100

1.2.3 單因素試驗

將發酵影響因子進行梯度化設計安排，以確定最佳值，其中米曲霉和黑曲霉體積比為 1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1，發酵溫度為 15、25、35、45、55 ℃，發酵時間為 60、80、100、120、140 d，拌曲鹽水濃度為 8%、10%、12%、14%、16%。依照上述條件進行單因素試驗，確定單因素最佳發酵條件。

1.2.4 發酵工藝最優參數的確定

以蛋白質利用率為評價指標，依次進行米曲霉和黑曲霉比例、發酵溫度、發酵時間、拌曲鹽水濃度的單因素試驗，并確定四因素三水平的最佳參數進行響應面分析。試驗設計水平及編碼見表1。

表1 響應面試驗因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 米曲霉和黑曲霉比例對蛋白質利用率的影響米曲霉和黑曲霉比例對蛋白質利用率的影響結果見圖1。

圖1 米曲霉和黑曲霉比例對蛋白質利用率的影響Fig.1 Influence of Aspergillus oryzae and Aspergillus Niger ratio on the utilization ratio

從圖1中可得出，米曲霉和黑曲霉比例對蛋白利用率有一定的影響，比例在1∶3和2∶1之間時，蛋白質利用率隨著比例增大而升高，且2∶1時利用率最高為85.59%，比例繼續增大利用率降低，可能是米曲霉和黑曲霉分泌的蛋白酶不同所導致[9]，米曲霉主要分泌中性和堿性蛋白酶，黑曲霉主要為酸性蛋白酶，當兩者比例為2∶1時，所產生的蛋白酶效果最好。

2.1.2 發酵溫度對蛋白質利用率的影響

發酵溫度對蛋白質利用率的影響結果見圖2。

圖2 發酵溫度對蛋白質利用率的影響Fig.2 Influence of fermentation temperature on the utilization ratio

從圖2可以看出，在溫度為15℃到45℃之間，隨著溫度升高蛋白質利用率逐漸增大，45℃時蛋白質利用率最大，為86.89%。發酵溫度和酶活力有一定關系，因為酶有最適發酵溫度，過高過低都會降低酶活力，從而導致蛋白質利用率降低[10]。

2.1.3 發酵時間對蛋白質利用率的影響

發酵時間對蛋白質利用率的影響結果見圖3。

圖3 發酵時間對蛋白質利用率的影響Fig.3 Influence of fermentation time on the utilization ratio

如圖3所示，發酵時間在60 d～100 d之間時，隨著時間延長，蛋白質利用率逐漸增大，100 d～140 d之間時，蛋白質利用率隨之降低，發酵時間為100 d時，蛋白質利用率最大，為86.89%。

2.1.4 拌曲鹽水濃度對蛋白質利用率的影響

拌曲鹽水濃度對蛋白質利用率的影響結果見圖4。

圖4 拌曲鹽水濃度對蛋白質利用率的影響Fig.4 Influence of concentration of the brine on the utilization ratio

由圖4可知，拌曲鹽水濃度在8%～12%之間，蛋白質利用率逐漸增大，拌曲鹽水濃度在12%～16%之間，蛋白質利用率隨之減小，拌曲濃度為12%時蛋白質利用率最大86.78%。食鹽有抑制微生物生長的作用，同時對酶活力也有抑制作用，濃度過高時致使蛋白質利用率降低[11]。

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 響應面試驗設計及結果

根據Box-Behnken中心組合設計原理，在單因素試驗的基礎上，以米曲霉和黑曲霉（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）、拌曲鹽水濃度（D）為試驗因素設計了四因素三水平的響應面分析試驗，試驗設計及結果見表2。

2.2.2 響應面試驗及方差分析

利用Design Expert軟件中的Box-Behnken Design模型對表2數據進行二次響應面回歸分析，得到回歸方程為：

表2 Box-Behnken響應面試驗設計與結果Table 2 Results of response surface experiment

Y=88.35+1.03A-1.16B+0.52C+0.019D-0.92AB-1.39AC+0.052AD-0.91BC+0.21BD-0.02CD-6.35A2-0.34B2-4.39C2-9.18D2，模型方差分析及回歸系數顯著性檢驗結果如表3所示。

表3 回歸方程各項的方差分析Table 3 Variance analysis for each item of the regression equation for ACE inhibitory activity of products as a function of four variables

從表3中可知，蛋白質利用率的一次項和二次項極其顯著，從而得知各因素對響應值的影響不是簡單的一次性關系，各因素之間的交互作用較好，構成了整個響應面結果。同時，總回歸項極為顯著，證明方程擬合程度較好，說明試驗可信性和準確性較高，失擬項極不顯著，說明試驗誤差很小。通過Design-Expert軟件分析得出，最佳發酵條件為：米曲霉∶黑曲霉=2.09∶1、發酵溫度42.86℃、發酵時間101.21 d、拌曲鹽水濃度12%，蛋白質利用率的理論值為89.03%。

2.2.3 響應曲面分析

通過軟件分析得出米曲霉和黑曲霉（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）和拌曲鹽水濃度（D）對蛋白質利用率的影響[12]，結果如圖5～圖10。

圖5 米曲霉∶黑曲霉和發酵溫度對蛋白質利用率影響的響應面Fig.5 Response surface plot for the utilization ratio of protein of products under different Aspergillus oryzae-to-Aspergillus Niger ratio and fermentation temperature

圖6 米曲霉∶黑曲霉和發酵時間對蛋白質利用率影響的響應面Fig.6 Response surface plot for the utilization ratio of protein of products under different Aspergillus oryzae-to-Aspergillus Niger ratio and fermentation time

圖7 米曲霉∶黑曲霉和拌曲鹽水濃度對蛋白質利用率影響的響應面Fig.7 Response surface plot for the utilization ratio of protein of products under different Aspergillus oryzae-to-Aspergillus Niger ratio and concentration of the brine

圖8 發酵溫度和發酵時間對蛋白質利用率影響的響應面Fig.8 Response surface plot for the utilization ratio of protein of products under different fermentation temperature and fermentation time

圖9 發酵溫度和拌曲鹽水濃度對蛋白質利用率影響的響應面Fig.9 Response surface plot for the utilization ratio of protein of products under different fermentation temperature and concentration of the brine

圖10 發酵時間和拌曲鹽水濃度蛋白質利用率影響的響應面Fig.10 Response surface plot for the utilization ratio of protein of products under different fermentation time and concentration of the brine

由響應面圖5～圖10可知，4個因子對響應值的敏感程度，米曲霉：黑曲霉響應曲面最陡峭，對蛋白質利用率作用最顯著，其次是發酵時間，再次是發酵溫度，最后是拌曲鹽水濃度。

2.2.4 驗證試驗

驗證試驗結果見表4。

表4 最佳發酵條件驗證試驗Table 4 The validation for the optimal fermentation condition

考慮實際操作條件，將上述最佳發酵條件修正為米曲霉∶黑曲霉=2.09∶1（體積比）、發酵溫度 43 ℃、發酵時間101 d、拌曲鹽水濃度12%。該條件下平行3次測定蛋白質利用率均值為88.99%，相對誤差為0.35%，表明該方程與實際情況擬合很好，具有一定的指導意義。

3 結論

通過單因素試驗得出發酵因素水平范圍，利用Box-Behnken四因素三水平試驗設計優化因素水平，應用Design-Expert軟件對試驗進行結果分析，以蛋白質利用率為指標得出最佳發酵條件，即米曲霉∶黑曲霉=2.09∶1（體積比）、發酵溫度 43℃、發酵時間 101 d、拌曲鹽水濃度12%，蛋白質利用率為88.99%，與理論值基本相符。在此發酵條件下，能更有效的利用蛋白質，減少原料的浪費，同時可得到良好風味的醬油，為工業發酵利用提供試驗基礎。