不同濃度麝香含藥血清對骨髓間充質干細胞遷移影響的實驗研究

李應福 謝興文,2* 李寧 侯費祎 蔣國鵬 潘鑫戊 周文杰

1.甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 7300502.甘肅省中醫藥研究院，甘肅 蘭州 7305003.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 7300004.蘭州軍區總醫院，甘肅 蘭州 730050

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymalstem cells，BMSCs)具有較強的多向分化潛力和增殖能力[1-2]，研究發現在損傷部位使用適當的生長因子或細胞因子聯合生物相容性良好、無組織刺激、容易塑性、可被機體吸收的生物支架上可刺激BMSCs向成骨或軟骨方向分化[3-4]。這充分利用了BMSCs易獲取、培養時間短、分化潛能高、細胞黏附性好、增殖速度快、免疫耐受性好、低排斥反應、其特征不會隨機體的衰老而失去活性等特性，同時也為組織工程學研究治療骨缺損、骨折等疾病帶來了新的希望。盡管BMSCs移植能治療創傷、心腦血管等疾病，但由于BMSCs體內數量有限，能遷移至損傷部位參與修復的BMSCs更少，這會影響其修復效果[5-6]。因此，研究促進BMSCs大量增殖并快速遷移的方法具有重要意義。麝香的有效成分是麝香酮，有研究表明麝香酮可促進BMSCs在體內的增殖，并誘導其向成骨細胞分化[7]。本實驗通過麝香含藥血清干預體外BMSCs，研究其對大鼠BMSCs增殖、遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：SD大鼠60只，雌雄各半，體重(200±20)g，用于制備含藥血清，雄性SD大鼠15只，體重(170±20)g，用于提取BMSCs，購于甘肅中醫藥大學SPF實驗中心。實驗動物質量合格證號：SCXK 甘 2015-0002，動物飼養于甘肅中醫藥大學SPF實驗中心。

1.1.2實驗藥物、試劑：麝香(蘭州安泰堂天順行藥業公司，批號：20151001)由甘肅中醫藥大學中藥鑒定學教研室鑒定，為天然麝香。氯胺酮(西安力邦制藥有限公司，國藥準字H20054749)；DMEM/F12培養基(HyClone公司，批號：AAL208968)，胎牛血清(Gibco公司，批號：17423078)，成骨誘導分化培養基試劑盒(Cyagen公司，批號：T160608G001)，成脂誘導分化培養基試劑盒(Cyagen公司，批號：T160104G001)，FITC標記兔抗鼠CD90、CD44、CD45(美國Bio Legend公司)，FITC標記兔抗鼠CD34(美國Abcam公司)。

1.1.3實驗設備：二氧化碳培養箱(MCO-5AC型，日本三洋電機公司)，自動攝像倒置相差顯微鏡(PW-30型，日本OLYMPUS公司)，立式電熱壓力滅菌器(LMQ型，山東新華醫療器械有限公司)，6、24孔細胞培養板(CORNING，美國Coring Costar)，流式細胞檢測儀(COULTER EPICS XL，美國Beckman FAScan公司)，超凈工作臺(SW-CJ-1 FD 型，蘇州凈化股份有限公司)，低速臺式離心機(TDZ4-WS型，長沙平凡儀器有限公司)，超純水系統(NW型，北京Heal Force公司)。

1.2 方法

1.2.1分組與給藥：60只SD大鼠采用隨機數字表法分為麝香高劑量組(16.8 mg/100 g)、麝香中劑量組(8.4 mg/100 g)、麝香低劑量組(4.2 mg/100 g)及空白對照組，共4組，每組15只(高劑量組：雄性6只，雌性9只；中劑量組：雄性8只，雌性7只；低劑量組：雄10性只，雌性5只；空白組：雄性6只，雌性9只)，將麝香充分研磨成細末并利用生理鹽水稀釋至2.5 mL，制成麝香混懸液進行灌胃，空白對照組灌服相同體積的生理鹽水。

1.2.2含藥血清制備：高、中、低劑量麝香和生理鹽水灌胃SD大鼠，每日1次，連續灌胃8 d，第8天灌胃2 h后行腹主動脈采血，4 ℃離心(3 000 r/min)10 min，取上層血清，過濾除菌，-20 ℃保存備用。

1.2.3體外分離、培養、鑒定BMSCs：參照Xie等[8]全骨髓貼壁篩選法，SD大鼠脫頸處死，無菌分離雙側股骨與脛骨，利用無菌紗布塊剝離附著于股骨與脛骨的肌肉并將其分離，剪去股骨與脛骨干骺端，顯露骨髓腔，用5 mL無菌注射器抽取含10%FBS、100 U/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM/F12培養液反復沖洗骨髓腔，直至骨髓腔變白，制成單細胞懸液，過濾并接種于60 mm無菌細胞培養皿中，4 mL/皿，置于5% CO2、37 ℃培養箱中培養。原代細胞隔1 d半量換液，換2次后每3 d換液。待原代細胞融合成單層后，可用含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化細胞，按1∶3比例接種到新的無菌培養皿中，每3 d換液1次。當細胞融合成單層或接近單層時可繼續傳代，傳至P3代時，用于后續實驗。細胞接種后每3 d在倒置相差顯微鏡下觀察BMSCs形態。P3代細胞達到80%～90%融合時，用含0.02%EDTA 的0.25%胰酶消化細胞，將細胞懸液1 000 r/min離心10 min，吸棄上清，加PBS后1 000 r/min離心10 min，棄上清，加PBS并制成單細胞懸液，調整為1×106cells/cm2，1 500 r/min離心10 min，棄上清，先加入90 μL PBS，吹打為細胞懸液，再加入一抗(CD34、CD45、CD90、CD44)及其同型對照各10 μL，37 ℃避光30 min后加400 μL PBS，上流式細胞儀檢測。

1.2.4細胞成骨、成脂誘導：用胰酶消化P3代細胞，調整細胞為2×104cells/cm2接種在包被0.1%明膠的六孔板中，每孔加入2 mL完全培養基，置入37 ℃、含5%CO2培養箱內培養，當細胞達60%～70%融合度時，加入2 mL成骨誘導完全培養基，每3 d換液1次。誘導17 d后，用茜素紅染色法對鈣化結節染色；當細胞融合度達90%～100%時，加入2 mL成脂誘導完全培養基A液，誘導3 d后，吸棄A液，加入2 mL成脂誘導完全培養基B液，24 h后吸棄B液，換A液誘導，A液和B液交替作用18 d后，繼續用B液培養7 d，共誘導25 d后進行油紅O染色。

1.2.5MTT法檢測麝香含藥血清對BMSCs增殖的影響：P3代BMSCs加入含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化細胞，制備單細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清加入完全培養基重懸細胞，調整細胞濃度為1×l05個/mL，按每孔2×104個接種至96孔板，分為空白組血清、麝香低、中、高劑量組血清，濃度均為5%完全培養液，各組培養液中均含有5% FBS，每組10個孔。每孔依次加入不同組別的完全培養液200 μL，24 h后加入20 μL MTT，4 h后加入150 μL DMSO，搖床震蕩10 min，490 nm波長檢測各孔OD值。每24 h換液一次，連續檢測7 d樣品OD值，重復3次。

1.2.6Transwell小室檢測麝香含藥血清對BMSCs遷移的影響：P3代BMSCs融合度達80%～90%時，用含0.02%EDTA 的0.25%胰酶消化細胞加入無血清培養基，按1×105cells/cm2的細胞密度接種在24孔Transwell孔板上層培養小室中，分為不同濃度麝香含藥血清組、空白對照組共4組，每組6個復孔，每孔200 μL，實驗重復2次。在Transwell孔板下層培養小室中分別加入含5%的含藥血清、5%空白組血清完全培養液，置于37 ℃、含5%CO2培養箱內培養，分別在24 h、48 h、72 h測細胞遷移。檢測步驟：(1)取出24孔培養板，吸棄小室上層培養基，將小室轉移至新孔中；(2)PBS沖洗小室2次，棄PBS；(3)4%多聚甲醛固定15 min，PBS沖洗小室2次，棄PBS；(4)超凈工作臺內適當風干后，加1%結晶紫溶液，避光染色15 min，吸棄染液；(5)PBS沖洗小室2次，棄PBS；(6)用棉球擦去小室上室的細胞，PBS沖洗小室2次，棄PBS；(7)每個小室隨機選取6個視野，拍照計數，紫色細胞為遷移的細胞。倒置相差顯微鏡下(×20)拍照，細胞計數后取其平均值。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 細胞形態學觀察

倒置相差顯微鏡下觀察，原代BMSCs第2次換液后細胞貼壁清晰可見，集落性分布，分離間距大，同時可見大量圓形雜細胞，多呈短棒狀(圖1)，P1代BMSCs培養3 d時細胞大量貼壁，形態以圓形和短梭形多見(圖2)；P2代BMSCs 2 h內迅速貼壁，培養3 d時梭形狀增殖，體積變大，具有細胞突起(圖3)；P3代BMSCs貼壁快、生長速度快，培養3 d時細胞集落快速增殖，體積明顯增大(圖4)。

圖3 P2代BMSCs培養3 d (20×)Fig.3 P2 generation BMSCs culture 3 d (20×)

圖4 P3代BMSCs培養3 d (20×)Fig.4 P3 generation BMSCs culture 3 d (20×)

2.2 細胞表型鑒定結果

CD90、CD44在干細胞表面的表達陽性率分別為93.8%、95.7%，CD45、CD34在干細胞表面的表達陽性率分別為0.4%、0.0%，說明CD90、CD44是陽性表達(圖5、6)，CD45、CD34是陰性表達(圖7、8)。

圖5 CD90表達Fig.5 Expression of CD90

圖6 CD44表達Fig.6 Expression of CD44

圖7 CD45表達Fig.7 Expression of CD45

圖8 CD34表達Fig.8 Expression of CD34

2.3 BMSCs成骨、成脂分化

經茜素紅染色后，倒置相差顯微鏡下可見圓形、梭形、多邊形礦化不透明結節，呈橘紅色的鈣化結節(圖9)。經油紅O染色后，倒置相差顯微鏡下可見細胞漿內呈大小不等的圓形或橢圓形、排列整齊規則的紅色脂肪滴顆粒(圖10)。

圖9 BMSCs成骨誘導(20×)Fig.9 BMSCs osteogenic induction (20×)

圖10 BMSCs成脂誘導(20×)Fig.10 BMSCs induced adipogenesis (20×)

2.4 麝香含藥血清對BMSCs增殖、遷移的影響結果

表1 不同濃度麝香含藥血清對BMSCs增殖率的影響 Table 1 Effects of different concentrations of musk containing serum on the proliferation rate of BMSCs

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

表2 不同濃度麝香對BMSCs遷移的比較 Table 2 Comparison of migration of BMSCs at different concentrations of musk

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與低劑量組比較，ΔP<0.05。

2.4.1MTT結果：MTT結果顯示(圖11，表1)，不同組間比較，各個時間段差異均有統計學意義(P<0.05)。與對照組相比，第1天麝香高、中、低劑量組差異有統計學意義(P<0.05)，低劑量組更顯著(P<0.01)；第2天麝香低劑量組差異有統計學意義(P<0.05)，第3天麝香中、低劑量組差異有統計學意義(P<0.05)，低劑量組更顯著(P<0.01)；第4、5天麝香低劑量組差異有統計學意義(P<0.05)，第6天麝香中、低劑量組差異均有統計學意義(P<0.05)；第7天麝香低劑量組差異有統計學意義(P<0.01)，說明麝香低劑量對BMSCs增殖影響最大。

圖11 不同組別BMSCs生長曲線Fig.11 Growth curves of BMSCs in different groups

2.4.2Transwell細胞遷移實驗：結果顯示(表2)，不同組間比較，24 h、48 h、72 h的差異均有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較，孵育BMSCs 24 h時，麝香高、中、低劑量組差異有統計學意義(P<0.05)，中劑量組更顯著(P<0.01)；孵育BMSCs 48 h時，麝香中、低劑量組差異有統計學意義(P<0.05)，低劑量組更顯著(P<0.01)；孵育BMSCs 72 h時，麝香低劑量組差異有統計學意義(P<0.01)；與麝香低劑量組比較，麝香高劑量組孵育BMSCs 24 h時差異有統計學意義(P<0.05)，麝香中劑量組孵育BMSCs 48 h、72 h時差異有統計學意義(P<0.05)。不同時間段組內比較，差異無統計學意義(P>0.05)。提示不同濃度麝香均能促BMSCs遷移，以麝香低劑量組效果最好。

研究結果顯示(圖12～14)，組間比較，孵育24 h、48 h、72 h時BMSCs遷移數均隨著麝香濃度的降低而逐漸增加，空白組其遷移數最少； 組內比較，不同時間段各組BMSCs遷移數均增加。

圖12 孵育24 h對BMSCs的遷移情況(A～D依次為麝香高劑量組、中劑量組、低劑量組、對照組)Fig.12 Incubation for 24 h affects the migration of BMSCs (A-D were high, medium, low dose musk group and control group)

圖13 孵育48 h對BMSCs的遷移情況(A～D依次為麝香高劑量組、中劑量組、低劑量組、對照組)Fig.13 Incubation for 48 h affects the migration of BMSCs (A-D were high, medium, low dose musk group and control group)

圖14 孵育72 h對BMSCs的遷移情況(A～D依次為麝香高劑量組、中劑量組、低劑量組、對照組)Fig.14 Incubation for 72 h affects the migration of BMSCs (A-D were high, medium, low dose musk group and control group)

3 討論

由于BMSCs具有取材簡便、擴增迅速、低免疫原性、多向分化潛能等優點，被認為是移植領域或聯合生物材料方面應用前景廣闊的種子細胞[9]，越來越多地用于骨科和內科臨床難治性疾病的治療。雖然BMSCs在全骨髓中含量為0.0001%～0.0010%，但一方面選擇純化度高的體外培養BMSCs方法時其具有很強的增殖分化、遷移潛能，另一方面選擇一種載體或藥物干預時其具有迅速增殖、定向分化并遷移至損傷部位的作用[10]，目前后者是研究的熱點之一。近年來，眾多學者應用現代科技手段多方位、多角度、多層次對中藥促進BMSCs增殖、分化、遷移方面做了大量實驗研究并取得了滿意的效果。熊云譜等[11]通過補腎活血湯含藥血清的干預觀察對BMSCs遷移的影響，發現補腎活血湯可促進BMSCs的增殖和遷移，而這種遷移機制與活化SDF-1/CXCR4軸具有相關性，這為臨床治療加快骨折愈合、縮短骨折愈合時間及防止骨折延遲愈合等疾病提供了基礎依據。王俊等[12]觀察中藥川芎嗪對BMSCs遷移的影響，通過采用Transwell細胞遷移、細胞劃痕、Western blot實驗發現川芎嗪在體外能促進BMSCs遷移，其機制與上調基質金屬蛋白酶-2、9表達有關。黃小兵等[13]通過龜板含藥血清對BMSCs的干預，發現龜板含藥血清明顯增強BMSCs的遷移能力，且與濃度呈正相關。以上從另一方面驗證了中藥單體或復方具有促進干細胞遷移的作用，具有很大的研究價值。

傳統名貴稀有中藥麝香，味辛、性溫，具有引藥達損傷部位，預防和治療疾病的作用，是引經藥物代表之一。筆者通過制備不同濃度麝香含藥血清，體外干預大鼠BMSCs，觀察麝香對其增殖、遷移的影響。在促BMSCs遷移實驗中，Transwell孔板下層培養小室中分別加入含5%的含藥血清、5%空白組血清完全培養液，這樣不僅能充分發揮細胞的生物學活性，而且最大程度地避免血清中含有的其他成分影響BMSCs的遷移作用。實驗結果表明，體外BMSCs自身可能具有遷移能力，不同濃度麝香在24 h、48 h、72 h更能促進BMSCs的遷移能力，并且其遷移數量隨著麝香濃度的遞減及時間延長而增加，這與細胞增殖率的結果相一致。說明麝香促BMSCs遷移效應與濃度呈負相關、與時間呈正相關，因此促BMSCs遷移能力最強的是低濃度麝香。

總之，本研究結果表明，麝香在體外能促進BMSCs遷移，與濃度呈負相關。這對探討外源性BMSCs輸入體內，使其遷移至骨折、骨缺損處，從而加快修復速度具有極其重要的意義，也為治療內科、骨傷科等疾病提供新的思路。但麝香中劑量組和高劑量組為何促增殖及遷移作用??？具體通過調控哪些細胞因子、生長因子以及活化哪條或哪些信號通路的開放促進BMSCs遷移？還需要不懈的研究與探索。