醫(yī)學(xué)3D打印技術(shù)在視網(wǎng)膜修復(fù)的研究進(jìn)展

謝雨杉，汪艷芳 ，黃文華，2

1.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖國家重點(diǎn)學(xué)科，廣東廣州510515；2.廣東省醫(yī)學(xué)3D打印應(yīng)用轉(zhuǎn)化工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510515

前言

視網(wǎng)膜損傷和退行性病變是引起嚴(yán)重視力損傷甚至失明的重要原因［1］。如何修復(fù)受損的視網(wǎng)膜是臨床治療中長期存在的一大難題。視網(wǎng)膜細(xì)胞移植及促細(xì)胞生長的相關(guān)因子注射是很有潛力的治療手段，但如何獲得安全有效、數(shù)量可觀的移植供體并實(shí)現(xiàn)移植后的細(xì)胞存活、整合，仍是我們亟需解決的問題。近年來，隨著3D生物打印技術(shù)的發(fā)展，皮膚、骨組織紛紛被打印出來并成功移植，3D生物打印技術(shù)在組織工程的應(yīng)用方面展現(xiàn)了極大的優(yōu)勢［2］。許多相關(guān)領(lǐng)域的研究者們也對(duì)視網(wǎng)膜的3D生物打印做了不同嘗試，在不同類型的視網(wǎng)膜細(xì)胞領(lǐng)域取得了不錯(cuò)的進(jìn)展。本文將回顧現(xiàn)有階段所采用的生物打印技術(shù)及其各類型視網(wǎng)膜細(xì)胞生物打印的進(jìn)度，從而為今后創(chuàng)造可用于治療、可打印的功能性類視網(wǎng)膜組織器官提供指導(dǎo)和建議。

1 生物3D打印

1.1 打印技術(shù)

目前主要的生物3D打印技術(shù)有噴墨3D打印技術(shù)、微擠壓印刷技術(shù)、激光輔助打印技術(shù)等。

1.1.1 噴墨3D打印技術(shù) 噴墨3D打印技術(shù)是一種數(shù)字模型文件為基礎(chǔ)，運(yùn)用粉末狀金屬或塑料等可粘合材料，通過逐層堆疊累積的方式來構(gòu)造物體的技術(shù)（即“積層造形法”）［3］。過去其常在模具制造、工業(yè)設(shè)計(jì)等領(lǐng)域被用于制造模型，現(xiàn)正逐漸用于一些產(chǎn)品的直接制造，現(xiàn)在可以利用患者的細(xì)胞作為原材料打印功能齊全的器官。和之前的噴墨打印機(jī)一樣，將培養(yǎng)的生物墨水一層層堆積。噴墨生物3D打印有兩種常見的方式：連續(xù)噴墨印刷和按需滴墨噴墨印刷［4］。雖然噴墨打印可以提高沉積材料的吞吐量，但由于噴嘴存在一些缺陷，很難打印出高濃度的液體（超過1 000萬個(gè)細(xì)胞/mL），同時(shí)由于噴嘴附近的剪切壓力［5］，造成細(xì)胞損傷的風(fēng)險(xiǎn)增加［6］。

1.1.2 微擠壓印刷技術(shù) 微擠壓印刷技術(shù)是一種相對(duì)低成本和快速的方法，可以打印高度濃縮的細(xì)胞懸液［7］。使用加熱器將熱熔性材料熔化，材料先抽拉成絲狀，通過送絲裝置送進(jìn)熱熔噴頭，材料在噴頭內(nèi)加熱融化，噴頭沿零件截面輪廓和填充軌跡運(yùn)動(dòng)，同時(shí)按照CAD分層數(shù)據(jù)的路徑控制半流動(dòng)狀態(tài)的材料，擠出并沉積在指定的位置凝固成形，并與周圍的材料粘結(jié)，層層堆積成型。由于其在打印過程中需要加熱，與噴墨打印相比，細(xì)胞的生存能力更低［8］。

1.1.3 激光輔助打印技術(shù) 激光輔助打印是一種最昂貴的方法，它在保持細(xì)胞生存能力的同時(shí)增加了打印過程中細(xì)胞的濃度，但速度相對(duì)較慢，而且細(xì)胞植入的精度難以保證［9］。激光輔助生物打印可分為兩個(gè)類別：一是激光導(dǎo)致局部射流形成的細(xì)胞打印；二是過程涉及光聚合的成型技術(shù)。前者使用激光對(duì)生物墨水進(jìn)行局部加熱，形成高壓氣泡，導(dǎo)致射流形成。激光輔助生物打印的分辨率受到許多因素的影響，如激光能量密度、表面密度、基底濕度、基底和吸收層氣隙以及生物樣品層的厚度和黏度等。因此激光輔助打印技術(shù)速度相對(duì)較慢，而且細(xì)胞植入的精度難以保證。

1.1.4 靜電紡絲 靜電紡絲技術(shù)是指聚合物溶液或者熔體在高壓靜電場作用下形成纖維的過程，是一種簡單、快捷，且可以較大規(guī)模制備均勻、連續(xù)的一堆納米結(jié)構(gòu)材料的方法，其制備的纖維直徑可從幾十個(gè)納米到幾微米，可以對(duì)人造肌肉、神經(jīng)、血管等復(fù)雜的人體組織器官進(jìn)行模擬。影響靜電紡絲的因素有很多，包括紡絲溶液的固有性質(zhì)（例如聚合物種類、聚合物分子鏈結(jié)構(gòu)、溶液的濃度和粘度、溶液的導(dǎo)電性、溶劑的極性和表面張力情況等）、紡絲條件（例如電場強(qiáng)度、紡絲距離、聚合物溶液的擠出速度等）［10］。

1.2 支架結(jié)構(gòu)生物材料

為了改進(jìn)打印過程中，細(xì)胞懸液濃度難以控制的問題，可以用非細(xì)胞水凝膠來打印三維支架，之后在支架上含有生長因子的底物，并植入細(xì)胞［11］。經(jīng)觀察，細(xì)胞可以在這些支架上生長，并形成錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。但目前這項(xiàng)技術(shù)由于前期很難引導(dǎo)細(xì)胞定向生長，大多數(shù)應(yīng)用于骨和軟骨的打印［12］。

1.2.1 海藻酸鈉水凝膠 海藻酸鈉是從褐藻類的海帶或馬尾藻中提取碘和甘露醇后的副產(chǎn)物，海藻酸鈉具有良好的生物相容性、生物降解性和pH敏感性［13］。海藻酸鈉水凝膠與其他聚合物相比，具有價(jià)格低、來源豐富、易塑形、更好的親水性、易于細(xì)胞吸附、營養(yǎng)物質(zhì)易于滲透等特點(diǎn)。此外，海藻酸鈉還能促進(jìn)巨噬細(xì)胞和人漿細(xì)胞的許多免疫學(xué)功能。因此，其具有較好的生物相容性和力學(xué)性能，是目前最有前景的生物材料之一。

1.2.2 明膠 明膠是膠原經(jīng)溫和而不可逆的斷裂后的主要產(chǎn)物，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸大約有20種，而明膠就含有其中的18種，因此其還具有極高的生物相容性。明膠中缺少色氨酸，是膠原變性所得的產(chǎn)物，屬蛋白質(zhì)大分子范疇。明膠微球廣泛用于生物材料，因?yàn)槊髂z和光引發(fā)劑的混合物通過暴露于紫外線的環(huán)境下，可以在擠出期間或之后實(shí)現(xiàn)快速交聯(lián)［14］。此外，明膠具有豐富的整合素結(jié)合基序，如纖連蛋白、波形蛋白和體外結(jié)合蛋白，它們通常參與細(xì)胞增殖過程。雖然光固化成型技術(shù)是用于高分辨率明膠生物材料打印，但擠出式生物打印技術(shù)則是明膠生物材料打印最廣泛應(yīng)用的方法，并且其使用相對(duì)容易。

1.2.3 天然來源的人造支架 它是一系列的生物支架，可以用來承載視網(wǎng)膜3D打印的細(xì)胞，來源于體內(nèi)的已有組織和體內(nèi)元素的集合體。主要的天然支架有膠原薄膜、明膠支架、晶狀體囊、血漿、羊膜。天然的生物支架可以通過不同的物理、化學(xué)或酶學(xué)去細(xì)胞方法從細(xì)胞、組織和器官中獲得。天然生物支架具有良好的細(xì)胞相容性、力學(xué)特性以及生物降解性，有利于細(xì)胞生長、增殖、粘附及分化，可有效地降低其免疫源性，從而避免過敏反應(yīng)和疾病傳播。

1.2.4 去細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì) 細(xì)胞外基質(zhì)是細(xì)胞分泌到細(xì)胞外間充質(zhì)中的蛋白質(zhì)和多糖類大分子物質(zhì)，具有高度組織有序的細(xì)胞外微環(huán)境，可形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的網(wǎng)架，連接各個(gè)組織結(jié)構(gòu)，對(duì)細(xì)胞的生長、發(fā)育以及細(xì)胞生理活動(dòng)具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，是細(xì)胞的外環(huán)境。但是，天然的細(xì)胞外基質(zhì)是由多種蛋白質(zhì)組成（主要分為膠原、糖蛋白、氨基聚糖及蛋白聚糖、彈性蛋白4大類），由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不易在體外培養(yǎng)重構(gòu)。通過不同物理、化學(xué)或酶學(xué)去細(xì)胞方法從細(xì)胞、組織和器官獲得天然的細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)這一難題的解決提供了新的有效解決途徑。去細(xì)胞化基質(zhì)具有良好的細(xì)胞相容性、力學(xué)特性以及生物降解性，有利于細(xì)胞生長、增殖、粘附及分化，可有效地降低其免疫源性，從而避免過敏反應(yīng)和疾病傳播。去細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)是通過去除自身組織的細(xì)胞成分及一些小分子抗原，保留細(xì)胞外基質(zhì)，是最為接近正常組織結(jié)構(gòu)及微環(huán)境，理論上最為適合細(xì)胞的生長、分化及基質(zhì)分泌，它最近被認(rèn)為是生物打印應(yīng)用中具有巨大潛力的材料。各種蛋白質(zhì)、蛋白聚糖和糖蛋白的混合組成可以模仿原生組織的細(xì)胞基質(zhì)的組成。在符合生理溫度的條件下，豐富的膠原蛋白的凝膠化促進(jìn)了交聯(lián)的簡化，這是去細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)在打印過程中所具有的特定優(yōu)勢［15］。

2 神經(jīng)細(xì)胞打印

神經(jīng)細(xì)胞分化程度高，再生能力非常有限，如何制造一個(gè)具有三維結(jié)構(gòu)，同時(shí)保留細(xì)胞的神經(jīng)元表型和基本的電生理學(xué)的神經(jīng)細(xì)胞是目前神經(jīng)組織工程的一大難題。

Hu等［16］用微型光刻裝置，使用3-羥基丁酸酯和3-羥基戊酸酯的共聚物為原料，并從老鼠的脂肪組織中提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)，再加入FGF2因子，通過3D光固化的打印方式制備出仿生神經(jīng)，植入大鼠坐骨神經(jīng)損傷缺口中，28 d后觀察發(fā)現(xiàn)仿生神經(jīng)修復(fù)效果與自體移植效果相近。Johnson等［17］使用神經(jīng)干細(xì)胞、藻酸鹽、氯化鈣、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚己內(nèi)酯、硅酮和明膠水凝膠作為3D打印材料，通過微擠壓的打印方式制備出3D打印的空心導(dǎo)管，植入到神經(jīng)缺損的大鼠模型，經(jīng)過12周后，實(shí)驗(yàn)組與空白組進(jìn)行步態(tài)運(yùn)動(dòng)分析，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的抓力有明顯的提高，幾乎接近正常大鼠。Xu等［18］通過噴墨打印將NT2細(xì)胞和纖維蛋白凝膠逐層打印，制造除了具有神經(jīng)結(jié)構(gòu)和電生理特性的神經(jīng)元，NT2神經(jīng)元來自ATCC 3813555，培養(yǎng)液是10%的FBS，在37℃、5%CO2的標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果在光學(xué)顯微鏡下可以看到，細(xì)胞符合預(yù)先設(shè)計(jì)的圓形圖案，存活率74.2%±6.3%。電生理記錄顯示在組織內(nèi)外有Na+、K+濃度的變化，并檢測到了10～85 mV的電壓變化。打印細(xì)胞的存活率和細(xì)胞功能都有了很大的提升。

3 神經(jīng)節(jié)和神經(jīng)纖維層打印

單個(gè)神經(jīng)細(xì)胞的生存率和電生理功能可以得到保證，但是將一系列神經(jīng)細(xì)胞成功打印并生成具有功能性的神經(jīng)節(jié)甚至神經(jīng)纖維層將大大增加打印的難度，這需要保證細(xì)胞本身具有一定的生長可控性。

Kador等［19］創(chuàng)造了一個(gè)可生物降解的電紡（ES）支架，用來引導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGC）軸突的生長，模仿視網(wǎng)膜上的軸突定向，通過建立幾組不同的纖維結(jié)構(gòu)來進(jìn)行比較，如圖1所示。在電壓15 kV、流速2 mL/h、距離12 cm時(shí)具有最高的纖維走向一致性。利用這個(gè)支架，RGC的存活量明顯增加，并且在電生理特性上沒有顯著的變化。當(dāng)對(duì)校準(zhǔn)進(jìn)行分析時(shí)，有81%的RGC被觀察到，在支架纖維上的軸突與視網(wǎng)膜移植的神經(jīng)纖維層相比沒有差別。當(dāng)移植到視網(wǎng)膜移植體上時(shí)，在ES支架上的RGC遵循宿主視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維的放射狀模式，而RGC則直接以隨機(jī)的模式移植了軸突。因此，使用這種支架作為一種細(xì)胞輸送裝置，是朝著使用細(xì)胞移植療法治療青光眼和其他視網(wǎng)膜退化疾病邁出的重要一步。

圖1 纖維方向一致性占比Fig.1 Fiber directional coherency

指導(dǎo)RGC軸突向視神經(jīng)頭延伸是一個(gè)重要的難點(diǎn)，無論是在正常的發(fā)展過程中，還是在考慮RGC替代療法在傷害或疾病方面。在發(fā)育過程中，視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層中的RGC軸突被定向到視神經(jīng)頭，在視神經(jīng)的頭部，可以通過分泌一些可溶性的引導(dǎo)因子引導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞生長。Netrin-1是視網(wǎng)膜內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)，負(fù)責(zé)指導(dǎo)神經(jīng)在大腦皮層分支和定位［20］。

為了保證在軸突引導(dǎo)過程中Netrin-1濃度對(duì)于化學(xué)固定所需的量是足夠的，采用一種隨機(jī)的、非梯度成形的方法進(jìn)行固定。在-coated支架上培養(yǎng)Netrin-1，顯示了極化RGC數(shù)量的增加，即細(xì)胞只有一個(gè)軸突延伸。此外，在這些支架上培養(yǎng)的RGC也延長了軸突，這是因?yàn)樵谥Ъ苌系膎etrin-1集團(tuán)形成了一個(gè)引導(dǎo)神經(jīng)生長的濃度梯度。這些結(jié)果證明固定在支架上的Netrin-1的濃度足以引起生物反應(yīng)。其次，有必要確定光啟動(dòng)交聯(lián)的方法是否將使蛋白質(zhì)的最高濃度達(dá)到最高。為了確定這一點(diǎn)，熒光標(biāo)記的bsa-fitc蛋白通過兩種不同的紫外線活性交聯(lián)方式被固定。在第一種方法中，交聯(lián)劑最初是通過NHS的亞單位和可溶蛋白結(jié)合，然后通過光激活的二氮化單元進(jìn)行交聯(lián)。在第二種方法中，這個(gè)過程被逆轉(zhuǎn)了uv-crosslinker在溶液中和bsa-fitc蛋白質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，然后通過diazirine子單元與表面進(jìn)行耦合。樣品用可溶性BSA-FITC蛋白質(zhì)顯示熒光比，大幅提高耦合交聯(lián)的可控性。在此方法的固定化過程中觀察到的小點(diǎn)的熒光點(diǎn)，這可能代表了聚合的bsa-fitc的固定，而不是單一的單層細(xì)胞，這種方法是用一種化學(xué)方法或一種方法來形成的，因此在最初的可溶蛋白中固定不動(dòng)蛋白，產(chǎn)生更大的固定蛋白濃度，可以使用這種方法來檢測軸突引導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)［21］。

4 干細(xì)胞打印

再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域需要可修復(fù)、可替換和再生能力強(qiáng)的細(xì)胞，通過干細(xì)胞培養(yǎng)可達(dá)體外制造組織和器官的目的。人類胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞具有自我更新的能力。全能干細(xì)胞可以分化成所有的細(xì)胞類型有機(jī)體，而多能干細(xì)胞只能分化成為那些在成人中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞。Faulkner-Jones等［22］成功地通過噴墨打印機(jī)在方形網(wǎng)格的結(jié)構(gòu)中滴入細(xì)胞懸液，在每個(gè)正方形的角落上各分配了一滴，并在已有液滴的通道上覆蓋了新的液滴，通過在同一位置增加液滴，改變位置濃度偏移量，達(dá)到精準(zhǔn)打印的目的。同時(shí)采用閥瓣的方法，改良打印噴頭，降低打印時(shí)的溫度，提高細(xì)胞的生存率，并成功地打印出了一個(gè)細(xì)胞團(tuán)。

雖然，干細(xì)胞組織團(tuán)已經(jīng)被成功打印出來，但是其分化方向仍是一個(gè)難點(diǎn)，如何在打印過程中控制其分化程度是一個(gè)關(guān)鍵問題，一旦一些分化程度較低或異分化的細(xì)胞進(jìn)入人體，有可能會(huì)形成惡性腫瘤危害人體健康。因此，干細(xì)胞打印在應(yīng)用于臨床的道路上，還有很多關(guān)鍵問題要解決。

5 結(jié)論

總結(jié)上面的論述，將ES細(xì)胞移植支架與熱噴墨3D細(xì)胞打印技術(shù)結(jié)合在一起，能夠精確定位在支架表面的RGC。為保證生存能力、電生理功能和神經(jīng)病理，應(yīng)結(jié)合各個(gè)指標(biāo)最優(yōu)參數(shù)，可以將不同的媒介在不同的情況下進(jìn)行測試。當(dāng)在生長介質(zhì)中含有腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子時(shí)，RGC維持生存和正常的電生理功能，并在ES支架上顯示徑向軸突生長。這些結(jié)果表明，在未來的視網(wǎng)膜模型或治療方法的設(shè)計(jì)中，3D打印技術(shù)可能與復(fù)雜的ES表面結(jié)合在一起。同時(shí)，細(xì)胞變異水平、分化程度也應(yīng)引起人們的關(guān)注，保證生存率并不是需要解決的唯一問題，3D生物打印技術(shù)最終還應(yīng)以服務(wù)臨床為第一要?jiǎng)?wù)。

最近的研究表明，某些哺乳動(dòng)物的視網(wǎng)膜細(xì)胞、成年鼠RGC和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可以成功地打印出來，而不會(huì)喪失生存能力和某些表型特征［23］。雖然視網(wǎng)膜細(xì)胞的3D打印技術(shù)取得了令人鼓舞的進(jìn)展，但目前還沒有可以應(yīng)用于人體的打印材料。生物材料既要考慮材料在打印前后的安全性、生物相容性、機(jī)械性能、降解性能等，又要考慮材料能產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)型。同時(shí)還有干細(xì)胞的來源、培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化等諸多問題還有待于去解決。這也是接下來視網(wǎng)膜細(xì)胞3D打印所要解決的難題。隨著這些問題的解決，3D打印的視網(wǎng)膜才能真正應(yīng)用于臨床。