甲狀旁腺激素測定試劑盒行業標準的驗證

曲守方 于婷 孫楠 黃杰

[摘要] 目的 制定甲狀旁腺激素測定試劑盒行業標準，采用標準適用的化學發光法試劑盒進行驗證，評價標準的適用性。 方法 采用磁微粒化學發光法、化學發光微粒子免疫檢測法等5種不同廠家的試劑盒，按照擬定行業標準的要求和試驗方法，對檢出限、線性、準確度、精密度、特異性等項目進行驗證。 結果 試劑盒的檢出限不高于13.7 pg/mL;準確度、線性、精密度和特異性等其他項目均能滿足擬定甲狀旁腺激素測定試劑盒行業標準的要求。 結論 制訂甲狀旁腺激素測定試劑盒行業標準能夠規范甲狀旁腺激素測定試劑盒的技術要求，為甲狀旁腺激素的檢測工作及上市后的監督管理提供依據。

[關鍵詞] 甲狀旁腺激素;行業標準;化學發光;檢出限;線性;準確度;精密度;特異性

[中圖分類號] R446.6? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）01（c）-0105-04

[Abstract] Objective To establish the industry standard of parathyroid hormone assay kit， and to validate the standard by chemiluminescence detection kit， and to evaluate the applicability of the standard. Methods The detection limits， linearity， accuracy， precision and specificity of five kinds of kits from different manufacturers were verified by magnetic particle chemiluminescence and chemiluminescent particle immunoassay according to the requirements and test methods of formulating industry standards. Results The detection limit of the kit was not higher than 13.7 pg/mL， and other items such as accuracy， linearity， precision and specificity could meet the requirements of drafting the industry standard of parathyroid hormone detection kit. Conclusion The formulation of industry standard for parathyroid hormone detection kit can standardize the technical requirements of parathyroid hormone detection kit， and provide the basis for the detection of parathyroid hormone and the supervision and management after the listing.

[Key words] Parathyroid hormone; Industry standard; Chemiluminescent assay; Detection limit; Linearity; Accuracy; Precision; Specificity

甲狀旁腺激素是由甲狀旁腺主細胞合成和分泌的直鏈多肽激素。甲狀旁腺主細胞首先合成前甲狀旁腺激素原，含115個氨基酸，其在細胞內裂解為含有90個氨基酸的甲狀旁腺激素原，后者在細胞內裂解成為含84個氨基酸的多肽，即甲狀旁腺素，其分子量約為9.43 kD[1-3]。整分子甲狀旁腺激素經水解后產生氨基端片段、羧基端片段及中間片段。甲狀旁腺激素在第34～37個氨基酸的位置斷裂后，氨基端依然具有完整的甲狀旁腺激素全部生物活性，具有生物活性的整分子甲狀旁腺激素或氨基端片段半衰期很短[4-5]。甲狀旁腺激素調節鈣磷代謝，是維持機體鈣平衡的主要激素，其分泌水平影響著血鈣和血磷水平，促使血鈣水平升高，血磷水平下降[6-8]。其作用的主要靶器官是骨和腎臟，主要通過促進腎小管對鈣離子的重吸收和磷酸鹽的排泄，使血鈣濃度增加和血磷濃度下降。血清中甲狀旁腺激素水平過低導致低鈣血癥，從而導致一系列的并發癥，如肌肉痙攣、手足抽搐等，也可影響心臟功能，出現QT間期延長并導致心動過速、心室顫動，甚至心肌受損等。甲狀旁腺激素通過抑制近端腎小管磷酸鈉協同轉運蛋白增加腎臟排磷，其缺乏可引起高磷血癥。全段甲狀旁腺激素水平檢測也可用于評估和處理其他包括骨質疏松癥和腎性骨病在內的骨代謝疾病[9-13]。骨質疏松癥是一種由體內雌激素代謝紊亂導致的以骨量減少、脆性增加和易發骨折為特征的代謝性骨病。甲狀旁腺激素可加速骨襯細胞對新分化成骨細胞的招募及破骨細胞的增殖，抑制成骨細胞的凋亡，使骨量及骨密度增加。間歇性小劑量使用甲狀旁腺激素具有促進骨合成代謝作用，改善骨微結構，增加骨量，降低骨折發生。甲狀旁腺功能亢進會導致甲狀旁腺激素分泌增加，可以用于評估甲狀旁腺功能亢進。甲狀旁腺激素的半衰期僅為3～5 min，切除異常腺體后，甲狀旁腺激素濃度明顯降低。外科醫生通過測定甲狀旁腺激素就能評估切除是否完整以及全部分泌功能亢進的甲狀旁腺組織是否已完全從患者身上切除。手術時操作失誤導致的甲狀旁腺被意外切除或甲狀旁腺血供手術操作或能量器械熱損傷，可導致患者術后發生暫時性或永久性的甲狀旁腺功能減退，使甲狀旁腺激素分泌不足，從而引起低鈣血癥。因此，術后進行快速全段甲狀旁腺素是判斷低鈣血癥的最好方法。甲狀腺術后引流液中的甲狀旁腺激素水平可以用于判斷術后甲狀旁腺是否原位保留及原位保留甲狀旁腺激素的分泌功能[14-18]。因此，甲狀旁腺激素的檢測具有重要的臨床意義。

目前，我國國家食品藥品監督管理局批準的甲狀旁腺激素測定試劑盒有20多家，該試劑盒的檢測原理主要是基于雙抗體夾心法的抗原抗體間的免疫反應，包括以酶標記和（電）化學發光標記等標記方法的免疫分析試劑盒，可以用于定量檢測甲狀旁腺激素[19]。目前，尚無統一的甲狀旁腺激素國家標準或者行業標準，不同企業的甲狀旁腺激素產品技術要求不一致，產品質量也參差不齊，從而導致檢驗結果缺乏可比性，造成了醫療成本增加，醫療資源浪費。為加強對甲狀旁腺激素測定試劑盒的質量控制，迫切需要建立相關的行業標準，以便對市場上的該類試劑盒進行科學、合理的監督管理。按照國家食品藥品監督管理局制訂、修訂醫療器械的項目計劃，中國食品藥品檢定研究院（以下簡稱“我院”）在參考國內外不同甲狀旁腺激素測定試劑盒技術資料的基礎上，經過充分調研和征求意見，制訂了甲狀旁腺激素測定試劑（盒） 行業標準的技術要求，包括檢出限、線性、準確度、精密度、特異性等項目。本研究采用了適用甲狀旁腺激素測定試劑盒（化學發光法），對該行業標準進行驗證。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AutoLumo A2000全自動化學發光檢測儀（鄭州安圖生物工程股份有限公司）;Maglumi 2000 Plus全自動化學發光測定儀（深圳市新產業生物醫學工程股份有限公司）;IMMULITE 2000全自動化學發光免疫分析儀[西門子醫學診斷產品（上海）有限公司];Access 2全自動免疫分析儀[貝克曼庫爾特商貿（中國）有限公司];ARCHITECT i系統[雅培貿易（上海）有限公司]。

1.2 試藥

試劑盒：甲狀旁腺激素定量檢測試劑盒A（磁微粒化學發光法，生產批號：20151130、20160405、20160 629）;血清甲狀旁腺素（甲狀旁腺激素）測定試劑盒B（化學發光法，生產批號：064160712、064160407、0641 60224）;全段甲狀旁腺激素測定試劑盒C（化學發光法，生產批號：320）;甲狀旁腺激素測定試劑盒D（化學發光法，生產批號：622187）;全型甲狀旁腺激素測定試劑盒E（化學發光微粒子免疫檢測法，生產批號：00916B000）。

樣品：甲狀旁腺激素國際標準品（NIBSC code：95/646，100 μg/支）、甲狀旁腺激素國家候選品，均由我院提供。其他質控品等樣本均由企業提供。

2 方法與結果

2.1 檢測方法

按照擬定的行業標準試驗方法進行操作，具體內容如下：

2.1.1 檢出限? 生產企業應提供甲狀旁腺激素測定試劑盒的空白限、檢出限及參考區間等相關信息。根據提供的信息，對5份濃度近似檢出限的低值樣本進行檢測，每份樣本檢測5次，對檢測結果按照大小進行排序，符合以下的條件，即可認為生產企業提供的空白限和檢出限的設置基本合理：①低于生產企業提供的空白限數值的檢測結果的數量應不大于3個;②沒有高于生產企業提供的參考區間下限的檢測結果的數值。

2.1.2 線性? 將接近線性區間上限的高值樣本按一定比例稀釋成至少5個濃度，其中稀釋的最低濃度樣本須接近線性區間的下限。每一濃度的樣本至少重復測定2次，計算其平均值，將測定濃度的平均值與理論濃度或稀釋比例用最小二乘法進行直線擬合，并計算線性相關系數r，結果應不低于0.9900。

2.1.3 準確度? 有甲狀旁腺激素國家（或國際）標準品時：需將國家（或國際）標準品配制成試劑盒線性范圍內的高、低濃度的準確度樣品（至少2個濃度）進行檢測，重復3次，取平均值，計算測定結果的相對偏差，結果應在±15.0%;無國家（或國際）標準品時：采用回收率的方法。即將已知濃度的甲狀旁腺激素樣本加入到正常人血清中，所加入甲狀旁腺激素樣本與正常人血清B之間的體積比例為1∶9，計算回收率，結果應在85.0%～115.0%。

2.1.4 精密度? 批內精密度：用同一批號試劑盒，不同濃度的質控品（2～3個不同濃度）分別重復測定10次，計算測定結果的平均值和標準差，手工操作試劑盒測定結果的變異系數應不高于10.0%，全自動操作試劑盒測定結果的變異系數應不高于8.0%。批間精密度：使用3個批次試劑盒檢測不同濃度的質控品，計算測定結果的平均值和標準差，質控品的測定結果的變異系數應不高于15.0%。

2.1.5 特異性? 測定濃度為10 000 pg/mL的甲狀旁腺激素降解片段甲狀旁腺激素（1-34）和10 000 pg/mL的甲狀旁腺激素降解片段甲狀旁腺激素（39-84），平行測定2次，計算均值，結果應不高于6 pg/mL。

2.2 結果

2.2.1 檢出限? 在游離人絨毛膜促性腺激素（β-HCG）定量標記免疫分析試劑盒等行業標準中，提出了空白限的要求：即用零濃度校準品或樣本稀釋液作為樣本進行檢測，重復測定20次，計算信號值的平均值和標準差，根據試劑盒所用標準品的定標曲線方程或者零濃度校準品和相鄰校準品之間的濃度-信號值結果進行兩點回歸擬合得出一次方程，將（平均值+2×標準差）的信號值帶入上述方程中，求出對應的濃度值，即為空白限。根據全國醫用臨床檢驗實驗室和體外診斷系統標準化技術委員會（TC136）要求，甲狀旁腺激素測定試劑盒行業標準需要采用“檢出限”的要求。驗證的甲狀旁腺激素試劑盒的空白限為5.3 pg/mL，檢出限為13.7 pg/mL，參考區間為15～65 pg/mL;5份濃度接近檢出限的低值樣本重復檢測5次，檢測結果按照大小進行排序，結果為7.2～14.2 pg/mL。結果顯示，低于生產企業提供的空白限數值的檢測結果的數量是0個，沒有高于生產企業提供的參考區間下限的檢測結果，表明生產企業提供的空白限和檢出限的設置基本合理。因此，行業標準中規定試劑盒的檢出限應不高于13.7 pg/mL。

2.2.2 線性范圍及相關系數? 各企業的試劑盒均在線性區間內，劑量-反應曲線相關系數（r）：0.9955～0.9996，高于行業標準的r≥0.9900的要求，表明在試劑盒線性范圍內，量-效關系反應良好。

2.2.3 批內、批間精密度? 驗證的試劑盒均是全自動操作試劑盒，高值質控品（QC-H）和低值質控品（QC-L）測定結果的變異系數均不高于行業標準規定的上限8.0%，表明各試劑盒測定同一樣本的測定值穩定，重現性良好。

2.2.4 特異性? 目前，市場上甲狀旁腺激素測定試劑盒基本是測量全段甲狀旁腺激素。因此，選擇甲狀旁腺激素降解片段甲狀旁腺激素（1-34）和甲狀旁腺激素（39-84）作為特異性樣品，用于評價其干擾。各企業生產的試劑盒的測定結果均不高于3.1 pg/mL，部分企業生產的試劑盒對這兩個樣本沒有響應值;均低于行業標準的上限6 pg/mL。表明甲狀旁腺激素降解片段不會干擾全段甲狀旁腺激素的測定結果。見表1。

2.2.5 準確度? 準確度是試劑盒最重要的性能要求。目前，市場上沒有甲狀旁腺激素國家標準品;而Parathyroid Hormone 1-84國際標準品是重組人源的甲狀旁腺激素1-84，國內試劑盒生廠商只有少數幾家溯源到這一支標準品，故不能按照相對偏差對市場上所有的試劑盒進行要求。因此，甲狀旁腺激素測定試劑盒行業標準提供了相對偏差和回收率兩種方法進行評價。本研究采用溯源到國際標準品的試劑盒進行相對偏差的驗證，將國際標準品配制成試劑盒線性區間內的6種濃度梯度的樣品，計算國際標準品的測定值與理論值的相對偏差，結果在-2.1%～7.6%，符合行業標準的要求，表明試劑盒賦值準確。見表2。采用不能溯源到國際標準品的試劑盒進行回收率的驗證，將濃度為1153.5 pg/mL QC-H加入到正常人血清（7.8 pg/mL），測定結果為136.1 pg/mL，計算樣本的回收率為112%。準確度的驗證結果滿足甲狀旁腺激素測定試劑盒行業標準的要求。

3 討論

我國醫療器械體外診斷試劑產業發展迅猛，但是體外診斷試劑行業標準的制修訂工作進展緩慢，我國許多種類的體外診斷試劑產品沒有統一的行業標準，醫療器械的監督管理工作有待于加強[20-22]。目前，市場上甲狀旁腺激素測定試劑盒各自的技術要求參差不齊，缺乏統一的評價尺度，不能對其進行有效的性能評價。制訂合理有效的甲狀旁腺激素測定試劑盒行業標準具有十分重要的意義。

國家食品藥品監督管理總局批準的甲狀旁腺激素測定試劑盒包括磁微粒化學發光法、化學發光免疫分析法、熒光免疫層析法、量子點免疫熒光、酶聯免疫法、熒光磁微粒酶免法等，其中化學發光法試劑盒約占75%以上。與酶聯免疫法比較，化學發光法具有靈敏度高、線性范圍廣、操作方便等優點，在臨床甲狀旁腺激素檢測中應用廣泛。本研究采用化學發光法試劑盒進行驗證，并選擇國內常用的2種國產試劑盒和3種進口試劑盒進行驗證，均為全自動操作試劑盒。對這些試劑盒的檢出限、線性、準確度、精密度和特異性等進行驗證，結果均符合行業標準的要求。經驗證，制訂的甲狀旁腺激素測定試劑盒行業標準各項技術要求較為合理，可滿足該類試劑盒的性能評價，具有很好的應用性。

在以往，制訂的體外診斷試劑產品定量標記免疫分析試劑盒行業標準采用“空白限”的要求。根據全國醫用臨床檢驗實驗室和體外診斷系統標準化技術委員會要求，甲狀旁腺激素測定試劑盒行業標準采用“檢出限”的要求，并進行了驗證，結果符合要求。準確度是定量標記免疫分析試劑盒最關鍵的技術指標，在該行業標準中規定：如果有國家或國際參考品，必須采用相對偏差評價準確度;如果沒有國家或國際標準品，可以采用回收方法進行評價。本課題組正在開展甲狀旁腺激素國家標準品的研制工作，本研究中提供的一支國家候選品的驗證結果很不理想，相對偏差已經超過15%，說明原料的甲狀旁腺激素抗原表位不能與試劑盒包被的抗體有效結合。我院將繼續篩選甲狀旁腺激素原料制備國家標準品，以滿足甲狀旁腺激素測定試劑盒質量評價的需要。

[參考文獻]

[1]? 張萌萌.甲狀旁腺素的生物學研究與成骨作用[J].中國骨質疏松雜志，2017，12（23）：1648-1653.

[2]? Souberbielle JC，Roth H，Fouque DP. Parathyroid hormone measurement in CKD [J]. Kidney Int，2010，77（2）：93-100.

[3]? 邱丹丹，蔣松.慢性腎臟病甲狀旁腺激素代謝異常的研究進展[J].腎臟病與透析腎移植雜志，2017，2（26）：174-178.

[4]? Takahata M，Awad HA，O′Keefe RJ，et al. Endogenous Tissue Engineering：PTH Therapy for Skeletal Repair [J]. Cell Tissue Res，2012，347（3）：545-552.

[5]? Goettsch C，Iwata H，Aikawa E. Parathyroid hormone：critical bridge between bone metabolism and cardiovascular disease [J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2014，34（7）：1333-1335.

[6]? 朱建明，黃建平.甲狀旁腺功能減退癥的激素替代治療進展[J].醫藥導報，2017，36（A01）：59-61.

[7]? 周曉莉，饒一武，朱梅.甲狀腺癌術后血鈣及血清甲狀旁腺激素檢測的臨床意義[J].熱帶醫學雜志，2015，2（15）：237-240.

[8]? 陳澎濤.甲狀腺全切手術后患者甲狀旁腺激素和血鈣的水平變化[J].上海醫藥，2017，38（13）：45-47.

[9]? 周露，陳仁貴，葉婷，等.糖尿病腎病與慢性腎小球腎炎血液透析患者甲狀旁腺激素水平研究[J].臨床軍醫雜志，2018，4（46）：417-419.

[10]? 王忻，趙毅，朱悅，等.甲狀旁腺激素用于預防脊髓損傷后骨質疏松的實驗研究[J].臨床和實驗醫學雜志，2018， 3（17）：230-234.

[11]? 譚磊，邢攸軍.甲狀旁腺激素通過增加血管及骨的形成防治骨質疏松[J].中國骨質疏松雜志，2016，9（22）：1112-1115.

[12]? 劉明，潘薇，陳德才.甲狀旁腺激素治療骨質疏松癥的研究進展[J].中華骨質疏松和骨礦鹽疾病雜志，2012，2（5）：151-156.

[13]? 顏海彬，張炳云.聯合使用甲狀旁腺激素和辛伐他汀對去卵巢大鼠骨質疏松癥的治療有疊加效應[J].中國骨質疏松雜志，2016，3（22）：300-303.

[14]? 戴佳奇，張云，嚴杰，等.術中快速甲狀旁腺激素檢測在甲狀腺手術中的應用研究[J].中華內分泌外科雜志，2017， 4（11）：330-333.

[15]? 張立永，趙文新，黎世雄，等.甲狀腺術后引流液甲狀旁腺激素測定的意義探索[J].中華內分泌外科雜志，2017， 5（11）：395-398.

[16]? 晏龍強，李富新，章帥，等.甲狀腺癌行甲狀腺全切除術后甲狀旁腺激素水平變化的影響因素分析[J].中國全科醫學，2015，29（18）：3579-3581.

[17]? 王曉妹，朱文秀，宋博，等.甲狀腺癌全切除術圍術期常規化監測甲狀旁腺激素的臨床價值探討[J].國際檢驗醫學雜志，2016，13（37）：1836-1837.

[18]? 韓樹坤.繼發性甲狀旁腺功能亢進手術術中快速甲狀旁腺激素測定33例臨床分析[J].中國實用醫藥，2015， 7（10）：59-60.

[19]? 甘良英.甲狀旁腺激素及其檢測方法新進展[J].中國血液凈化，2016，5（15）：266-268.

[20]? 徐智勇，魯軍，高小坤.體外診斷試劑冷鏈管理[J].中國醫學裝備，2018，15（3）：110-112.

[21]? 高尚先，孫彬裕，曲守方，等.關于我國體外診斷試劑監督管理改革的建議[J].藥物分析雜志，2006，26（8）：1175-1180.

[22]? 楊海潔，蔣積余，吳永鑫，等.PDCA管理法在醫院體外診斷試劑管理中的應用[J].中國醫學裝備，2017，14（11）：129-132.

（收稿日期：2018-05-28? 本文編輯：王? ?蕾）