Toll樣受體4在出血性腦卒中后腦損傷及其治療中的作用研究進展

馮宇軒 姚聲濤 匡舒蔓 余國清 向成明

[摘要] 出血性腦卒中是一種較為常見的急危重癥，通常以腦實質內或腦底動脈環處血管破裂為主要的發病原因。近年來，國內外專家學者根據出血部位的差異將其分為多種類型，并通過研究分析后發現它們往往會由于繼發性腦損傷的發生而嚴重影響患者預后。然而最近有研究發現Toll樣受體4（TLR4）的信號轉導通路廣泛存在于腦出血后炎性反應、神經細胞凋亡以及腦血管痙攣和腦積水等繼發性腦損傷之中，并且通過抑制TLR4信號通路能夠減少腦損傷的發生率。因此，本文就目前TLR4在出血性腦卒中后腦損傷及其治療中的作用研究進展進行綜述。

[關鍵詞] 出血性腦卒中;Toll樣受體4;炎性反應;神經細胞凋亡;腦積水

[中圖分類號] R743.3? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）01（c）-0022-06

[Abstract] Hemorrhagic stroke is a common acute and severe illness. The main cause of the disease usually refers to the rupture of vessels in the cerebral parenchyma or circle of willis. Recently， domestic and foreign experts and scholars divide it into many types according to the area of hemorrhage， and they find that the occurence of secondary brain damage will influence the patients prognosis through research and analysis. However， recent studies have found that Toll-like receptor 4 （TLR4） signal transduction pathways are widespread in post-cerebral hemorrhage inflammation， neuronal apoptosis， cerebral vasospasm and hydrocephalus， and we can reduce the incidence of brain injury by inhibiting TLR4 signaling pathways. Therefore， this article reviews the research progress on the effect of TLR4 on brain injury and its treatment after hemorrhagic stroke.

[Key words] Hemorrhagic stroke; Toll-like receptor 4; Inflammatory response; Neuron apoptosis; Hydrocephalus

腦卒中又稱腦血管意外，是中樞神經系統中較為常見的疾病。臨床上主要將其分為出血性腦卒中和缺血性腦卒中。雖然出血性腦卒中在卒中患者中僅占據10%～15%，但是它具有極高的致死率和致殘率[1]。然而，令人遺憾的是目前并沒有臨床證據證明任何一種藥物治療能夠有效地提高患者的生存率和生活質量。因此尋找它的發病機制，并在疾病早期針對繼發性腦損傷的發生進行預防變得至關重要。以前，關于腦出血后腦損傷的機制，通常認為其主要原因是顱內出血后血腫形成，進而壓迫腦組織導致機械性損傷。近年來，通過大量的研究發現血細胞毒性、高代謝損傷、興奮毒性損傷、氧化應激等都能夠導致繼發性腦損傷[2]。最近，研究人員在對Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）的研究中發現它們在出血性腦卒中后腦損傷的各條病理通路中都起到了至關重要的作用。而Toll樣受體4作為其中一員在免疫識別、炎癥調節等各個方面扮演重要的角色[3]。因此，本文就近年來出血性腦卒中后繼發性腦損傷產生與TLR4之間相關性的研究進展進行綜述。

1 TLR4簡述

1.1 TLR4的歷史

研究人員最早于1980年通過甄別同種果蠅胚胎發育過程中的不同發現了Toll基因。此后通過長期堅持不懈的探索，終于在1997年克隆出第1個人的Toll受體同源物，并在后來將其命名為TLR4。翌年，人類另外4種TLR被發現。與此同時，TLR4也被確認為脂多糖（LPS）的信號受體。自此，關于TLR4的研究不斷深入。至今，已經在小鼠身上明確了13種哺乳動物的TLRs，并發現人類第11個TLR。

1.2 TLR4的結構和功能

1992年，西方學者首次提出模式識別受體這一概念，并認為非特異性免疫可通過模式識別受體識別多種病原微生物中高度保守的成分即病原體相關模式分子（pathogen associated molecular pattern，PAMP），從而產生免疫應答。目前的研究表明，TLR4屬于膜型模式識別受體中表達于細胞膜上的一種跨膜蛋白，由膜外區、膜內區以及跨膜區三個部分組成。并分別在外周血細胞中的血小板、白細胞、巨噬細胞和中樞神經系統中的小膠質細胞、星形膠質細胞、腦血管內皮細胞、神經元等細胞中廣泛分布[4-5]。而它主要是通過膜外識別PAMP，進而促進膜內的C端的Toll/IL-1受體結構域（Toll/IL-1R domain，TIR）介導信號傳導通路的啟動，從而引發一系列與免疫調控及炎癥誘導等相關的反應。

1.3 TLR4的信號傳導通路

近年來的研究發現，在目前已知的13種TLRs中TLR4和TLR3信號傳導通路與眾不同。其中最主要是因為TLR4具有與其他TLRs不同的胞內結構域，從而促使TLR4既能夠通過髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴性通路也能夠通過MyD88非依賴性通路發揮作用。在MyD88依賴性通路中，TIR結構域銜接蛋白（TIRAP）使MyD88與TLR4結合并形成多聚復合體，其中包括MyD88、白介素-1受體相關激酶4（IRAK4）以及白介素-1受體相關激酶1/2（IL-1 receptor-associated kinase 1/2，IRAK1/2）。再通過復合體中的相關激酶激活腫瘤壞死因子受體相關因子6（TNFR-associated factor 6，TRAF6）和轉化生長因子β激活激酶1（TGF-β-activated kinase-1，TAK1）后，與NF-κB關鍵調節因子（NEMO）結合促使核因子κB抑制蛋白激酶（IκB）磷酸化。并引起核轉錄因子（NF-κB）核轉位和炎性因子中的腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白介素1β（IL-1β）表達增加。另外，還可通過TAK1激活c-Jun氨基末端激酶（JNK1/2）、細胞外信號調節蛋白激酶（ERK1/2）和P38，最后激活轉錄因子活化蛋白-1（AP-1）發揮作用[6-8]。而在MyD88非依賴性通路中，TLR4發生某種特定的內化后進入胞內體通過募集Toll樣受體相關分子（TRAM）及Toll樣受體相關的干擾素活化子（TRIF）后形成復合體激活TRAF3，通過TRAF3泛素化作用激活TANK結合激酶1（TBK1）和核因子-κB抑制蛋白激酶ε（IKKε）。此后通過TBK1和IKKε促使干擾素調節因子3（IRF3）磷酸化，進而刺激抗炎細胞因子轉錄及Ⅰ型干擾素的生成[8-9]。

2 TLR4在出血后繼發性腦損傷中的作用

2.1 促進神經炎性反應

腦出血后神經炎性反應的發生，通常被認為是其產生繼發性腦損傷最為重要的因素，因而近年來深受學者們的青睞。然而腦出血如何通過炎性反應進而誘導繼發性腦損傷的發生機制往往極為復雜，通常涉及多條信號通路[10]。因此，我們還需要進一步深入研究。

據最新的研究顯示，TLRs信號通路在腦出血后誘發神經炎癥，不但可以通過慢性炎性反應抑制突觸傳遞從而影響腦損傷修復通路，還可誘使細胞毒性分子通過血腦屏障，從而在引發繼發性腦損害的過程中起到至關重要的作用。并且，通過整理大量的實驗研究結果后發現在TLRs家族中TLR4在腦出血后表達增加得最為明顯。其中Teng等[11]發現在小鼠腦出血模型建立后的6～72 h內TLR4 mRNA和NF-κB表達量不斷增加，并長期維持在較高水平，也只是在腦出血后的第7天才開始有所降低。此后，Sansing等[12]通過比較敲除TLR4基因的小鼠腦出血模型和野生型小鼠腦出血模型，不僅發現缺乏TLR4基因的小鼠CD36、CSF2和趨化因子CX3CL1的基因表達增加。而且還發現血腫周圍的巨噬細胞、中性粒細胞和單核細胞中的TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子表達水平明顯降低[13]。不僅僅只是神經炎性反應明顯降低，更為重要的是神經功能也得到了明顯的改善。由此，他們推斷可能抑制TLR4的信號傳導通路是控制腦出血誘發神經炎癥損傷的一種潛在治療手段。如今，該研究已經成為新的關注熱點。其中Zhou等[14]將新鮮血液注入9～12周齡的SD鼠的右側大腦半球的基底神經節處建立腦出血模型，并通過比較采取辛伐他汀治療和未采取干預手段的腦出血SD鼠，以及采取生理鹽水喂養的正常SD鼠的NF-κB、TLR4和IL-1β的陽性細胞表達量以及蛋白表達水平，得出辛伐他汀可以通過抑制NF-κB、TLR4和IL-1β的表達進而保護神經元并減少繼發性炎性反應的發生的結論。而后，Liu等[15]也通過動物實驗發現抗氧化蛋白1（peroxiredocin 1，Prx1）能夠通過激活TLR4炎癥信號通路上的ERK1/2和NF-κB并最終產生TNF-α、IL-6和IL-17等炎性因子，并認為阻斷Prx1-TLR4信號可能是對抗神經炎癥損害的新途徑。此后，Du等[16]在C57BL/6小鼠腹腔巨噬細胞中發現長鏈非編碼RNA（lncRNA）Mirt2。當巨噬細胞處于靜息狀態時，Mirt2低表達，而LPS刺激LPS-p38-STAT1以及LPS-IFN-α/β-STAT1通路的轉錄，可促進lncRNA Mirt2的表達，并在12 h內達到高峰。但是，當Mirt2被敲除后，LPS將快速激活TLR4炎癥信號通路使得炎性因子在20 h內迅速增加，從而產生嚴重的炎性反應。與此同時，作者通過實驗發現LPS是通過激活質膜上依賴于E3泛素連接酶TRAF6的促炎信號通路引發炎性反應。而Mirt2抑制TRAF6的Lys63（K63）連接的泛素化，從而抑制NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑的活化減輕炎性反應，并調控巨噬細胞的極化。由此可知lncRNA Mirt2是過度炎癥的負反饋調節劑。然而，雖然目前只在巨噬細胞、氣管上皮細胞和肝細胞中發現Mirt2的炎癥調節功能，但是Mirt2也很有可能是調節腦出血后繼發性神經炎性反應的關鍵因素之一。因此，如何將TLR4炎癥信號通路進行負性調節，從而減少腦出血后炎癥損傷的研究亟待更進一步深入。

2.2 介導神經細胞凋亡

神經細胞凋亡是腦出血后腦損傷較為重要的病理生理過程，主要發生于小膠質細胞、腦血管內皮細胞等中樞神經細胞中，并在早期引發細胞毒性腦水腫、神經功能缺損等不良反應。然而，目前針對腦出血后神經細胞凋亡的機制研究仍處在起步階段。因此，還需要進一步探索其發病機制。最近有研究表明通過調節TLR4信號通路能夠介導神經細胞凋亡。其中Jung等[17]研究發現TLR4的兩條信號通路激活均能誘導小膠質細胞的凋亡。首先TLR4通過MyD88依賴性通路激活NF-κB，進而增加含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶11（caspase-11）的表達。緊接著激活其下游通路的細胞凋亡執行者caspase-3誘導小膠質細胞凋亡。另外通過誘導一氧化氮合酶（iNOS）產生神經毒性介質一氧化氮（NO）也可以促進細胞凋亡。還可以通過TLR4的MyD88非依賴性通路使得IRF3磷酸化，進而產生干擾素β（IFN-β）。而后IFN-β通過對轉錄激活因子和信號轉導子1（STAT1）進行調控，從而激活STAT1/IRF-1信號通路產生NO激發小膠質細胞凋亡。而Wang等[18]分別采用視交叉前池注血法和頸總動脈-視交叉前池體外轉流法建立蛛網膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）模型，并從中挑選出最符合實驗研究的SAH小鼠，檢測出基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、TLR4、caspase3在6、12、24、48、72 h的mRNA表達情況，以及經過LPS預處理24 h后的基因表達情況。最終同樣發現TLR4可以通過識別HMGB1開啟信號傳導通路使得MMP-9表達上調并啟動凋亡程序。但經過低劑量LPS預處理后，TLR4信號通路激活反而使得MMP-9和caspase3表達下調從而抑制細胞凋亡并產生神經保護作用。因此這也為治療由SAH所導致的包括細胞凋亡性損傷在內的早期腦損傷提供了新的方向。此后，Hu等[19]在建立腦出血模型的Wistar鼠中通過腹腔注射不同劑量的銀杏內酯B（GB），并觀察不同時間段內腦組織中TLR4和NF-κB的基因表達情況以及TNF-α、IL-1β、IL-6和凋亡神經元數量變化情況。最終發現GB能夠通過抑制小膠質細胞中TLR4和NF-κB的基因表達，減少炎性反應的發生，進而抑制神經細胞凋亡。而Huang等[20]通過類似的方法發現氧化苦參堿也能夠通過抑制TLR4信號通路減少12/15脂氧（12/15-LOX）、磷酸化后的p38絲裂原活化蛋白激酶（phospho-p38 MAPK）和胞漿型磷脂酶A2（cPLA2）所引發的氧化性腦損傷，進而減少腦出血后神經細胞凋亡的數量。最近，Chen等[21]通過比較被敲除TLR4基因的腦出血小鼠和正常的腦出血小鼠分別經過逐瘀安腦丸治療后凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2在腦組織中的含量變化，最終發現缺乏TLR4基因的小鼠經過逐瘀安腦丸治療后Bax蛋白表達明顯降低，并伴隨著Bcl-2蛋白表達明顯增加。因此作者認為逐瘀安腦丸可能作用于TLR4信號通路使腦出血后腦損傷所介導的神經細胞凋亡發生率降低，但具體是藥物何種成分發揮作用還需進一步研究。

2.3 引發腦血管痙攣

腦血管痙攣是一種因顱內動脈受到出血刺激后產生持續性收縮，從而導致腦組織處于短暫性缺血狀態，并由此引發一系列腦缺血性神經功能障礙的腦血管疾病。它最早在1859年被發現并報道，但當時人們還并不知道它是如何產生并導致患者死亡。隨著醫療技術的發展人們慢慢地揭開了它的神秘面紗，并在1951年研究人員通過腦血管造影發現腦底動脈環處的動脈瘤破裂引發SAH是腦血管痙攣最主要的發病原因。而如今，學者們雖然通過對腦血管痙攣不斷深入的認識，并研究出許多關于SAH后腦血管痙攣治療的新方法、新技術，而且患者的治療也從原來的各種擴血管藥物治療、手術治療，到近年來通過缺血預處理來有效地預防動脈瘤性SAH后腦血管痙攣的發生[22]。但是，由于腦血管痙攣的發病機制仍籠罩在迷霧中，使得針對其治療的有效性一直無法得到提升。然而，神經學領域的專家通過多年來對SAH動物模型研究發現，SAH后腦血管痙攣的發生與TLR4信號通路傳導有著密切的關系。其中Suzuki等[23]在動脈瘤性SAH發生腦血管痙攣患者的腦脊液中發現肌糖蛋白C（tenascin-c，TNC）明顯增加。而后，Fujimoto等[24]將TNC注入正常小鼠腦池內促進大腦動脈的平滑肌層不斷收縮，并通過蛋白質免疫印跡（Western blot）技術觀察到TLR4的表達水平以及MAPK家族中的JNK和p38的磷酸化水平明顯增加。最終作者綜合實驗結果認為腦血管痙攣可能和TLR4激活MAPK信號通路密切相關，然而MAPK信號通路如何誘導SAH后腦血管痙攣的發生還無從得知。但最近Wu等[25]通過整理分析發現血管壁細胞增殖、血管平滑肌的持續收縮、免疫炎性反應、血管內皮細胞凋亡等可能是其作用機制。因此抑制TLR4/MAPK/NF-κB炎癥信號通路傳導也許是治療腦血管痙攣的方法之一。基于上述猜測，Kawakita等[26]通過IAXO-102選擇性地抑制TLR4受體的白細胞分化抗原14（CD14）和髓樣分化蛋白-2（MD-2）后，腦血管的內皮層以及平滑肌細胞層的環氧合酶-1（COX-1）明顯減少，并最終抑制SAH后腦血管痙攣。而后，Wu等[27]采用雙出血注射法制備SAH模型，并通過Western blot發現腹腔內注射羅格列酮后不僅使得基底動脈周邊的TLR4表達明顯減低，而且細胞間黏附分子1（IACM-1）以及髓過氧化物酶（MPO）也明顯減少。最終，作者認為SAH經羅格列酮預處理后通過抑制TLR4的信號通路，不僅能減少炎性反應，還能使SAH后腦血管痙攣得到緩解。然而經過大量的實驗研究發現TLR4拮抗劑并不能完全有效地控制腦血管痙攣的發生。最近Hanafy[28]提出的新觀點值得進一步思考，他認為腦血管痙攣治療較為棘手是因為腦血管痙攣分為早期腦血管痙攣和晚期腦血管痙攣，其中早期腦血管痙攣通過MyD88依賴性通路，而晚期腦血管痙攣通過MyD88非依賴性通路，因此針對不同時間點采取不同的治療措施或許能夠進一步提升療效。

2.4 誘發腦積水產生

急性出血性腦卒中并發腦積水產生在臨床上較為常見，其中腦室穿刺引流是最主要的治療手段。然而行腦室穿刺引流主要是因為發生了梗阻性腦積水或交通性腦積水后腦脊液循環受阻或吸收障礙。尤其是針對交通性腦積水，臨床上只一味地行腦室外引流或腰椎穿刺來減輕腦脊液的吸收障礙，卻對其形成機制知之甚少。但是在20世紀90年代，Tada等[29]發現通過鞘內注射人重組轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）后可以誘導小鼠交通性腦積水產生。而后，Kitazawa等[30]通過酶聯免疫吸附實驗分別檢測SAH伴腦積水形成和SAH后無腦積水形成患者腦脊液中TGF-β1含量變化，并通過Western blot來檢測腦脊液中TGF-β1表達水平。最終作者根據研究結果認定TGF-β1在SAH患者產生交通性腦積水過程中起到了至關重要的作用。隨著時間的推移，人們也逐漸認識到TGF-β1是通過促使蛛網膜下腔纖維化而引發蛛網膜顆粒及其軟腦膜腦脊液區域阻塞，并最終由此誘發腦積水。而與此同時血管內皮生長因子（VEGF）、MMPs等也被發現與腦積水產生有著千絲萬縷的聯系[31]。但是Kaestner等[32]通過臨床研究發現TGF-β1在SAH和腦室內出血后腦積水產生中并沒有起到決定性作用。而且也沒有充分的實驗證據證明其他的腦積水相關分子在腦出血后腦積水產生中起到主導性作用。因此關于腦積水產生的機制研究還需更進一步深入。

目前，研究人員對此提出了不同的見解。他們認為我們不能將思維僅僅局限于腦脊液循環失衡導致腦積水產生，而忽略腦脊液分泌增加在疾病發生過程中的潛在作用。對此，Karimy等[33]通過研究小兒腦積水發現腦脊液的分泌是通過物質的跨膜轉運完成。其中脈絡叢上皮基底側膜上的水通道蛋白1（aquaporin1，AQP1）、陰離子交換蛋白2、Na+-HCO3-交換蛋白和K+通道將Na+、K+、Cl-、HCO3-和H2O從血液轉運至脈絡叢上皮。而脈絡叢上皮頂端膜上的Na+/K+-ATP酶、Na+-K+-2Cl-共轉運體1（Na+-K+-2Cl- cotransporter 1，NKCC1）、Na+-HCO3-共轉運體2、K+-Cl-共轉運體4（K+-C1- and cotransporter 4，KCC4）和AQP1等共同作用將Na+、K+、Cl-、HCO3-和H2O從脈絡叢上皮釋放至腦脊液。相反，各種轉運體及轉運蛋白也可以將各種離子回收至脈絡叢上皮，從而抑制腦脊液過度分泌。但是當脈絡叢上皮受到某種刺激造成各種離子通道、轉運蛋白以及水通道蛋白發生紊亂時，腦脊液的分泌和重吸收失衡能夠促使腦脊液大量釋放引發腦積水。尤其是受STE20/SPS1相關脯氨酸/丙氨酸豐富的蛋白激酶（STE20/SPS1-related proline/alanine-rich kinase，SPAK）高度調節的NKCC1對細胞內Cl-濃度變化、細胞滲透壓以及炎性反應等極其敏感。因此當脈絡叢上皮細胞的內環境發生某種變化時，NKCC1表達增加可能會產生一系列連鎖反應，誘使腦脊液過度分泌。基于上述推斷，有研究發現，動物體內注射一定劑量的丁苯氧酸和呋喃苯胺酸分別抑制NKCC1和KCC可以減少腦脊液的產生[34-35]。而Chen等[36]通過敲除短暫性腦缺血模型小鼠的NKCC1基因后發現腦水腫體積減少了40%。但最近Karimy等[37]的發現進一步揭示了各種離子通道的信號轉導在腦出血后腦積水產生中的作用。他首先向大鼠腦室內注入不含LPS的自體血，建立腦積水模型，然后通過導管注射礦物油至第四腦室和中腦導水管，以阻斷腦脊液循環，最后將毛細導管插入側腦室計算腦脊液的實際產出量以及腦脊液分泌率。最終作者發現腦室內出血后腦脊液過度分泌的分子機制為TLR4通過MyD88依賴性通路激活NF-κB后再次激活SPAK，后者與NKCC1結合后使其磷酸化，最終激活NKCC1，引起腦脊液分泌過量。而后，他們先后敲除TLR4基因和SPAK基因后發現腦脊液分泌正常，并且腦積水癥狀顯著減輕。同樣，通過瑞沙托維抑制TLR4，吡咯烷二硫代氨基甲酸抑制NF-κB，克羅散泰抑制SPAK，布美他尼抑制NKCC1或使用STOCK1S-50699破壞SPAK-NKCC1共轉運體復合體也能達到相同的療效。因此作者認為通過藥物干預信號轉導或許能夠有效地增加腦出血后腦積水的治愈率，但由于缺乏臨床試驗研究尚未應用于腦室出血后腦積水的患者。倘若今后的研究證明該信號轉導通路存在于人體內，或許針對腦出血后頑固性腦積水的治療能夠迎來新的曙光。

3 展望

出血性腦卒中后繼發性腦損傷的產生通常需要經歷多個復雜的病理生理過程。其中TLR4分子在各種不同類型的損傷過程中都發揮了一定的作用，并且對TLR4及其下游通路的抑制往往能夠起到相應的保護作用。而最近報道的首例高活性的TLR8抑制劑值得進一步關注，因為以往的TLR抑制劑一般是通過阻斷TLR形成二聚體，而最新發現的小分子抑制劑能夠通過牢牢地鎖定已形成的TLR8二聚體的構象，從而起到信號傳導的阻斷作用[38]。雖然它只是TLRs中的一員，但是它為TLR4及其他TLR抑制劑的研究帶來了新的思路。因此我們有理由相信，通過更深層次地挖掘TLRs與出血性腦卒中后繼發性腦損傷的聯系，能夠為繼發性腦損傷的治療開拓新的道路。

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（收稿日期：2018-07-26? 本文編輯：羅喬荔）