昭通天麻多糖含量測定及超聲輔助提取條件優化

程立君 彭佳華 胡志芳 高文 茶勇

摘? 要：采用苯酚—硫酸法對昭通天麻多糖含量測定，結果顯示：在490nm波長處測定吸光度，在濃度0～0.0175mg/mL線性關系良好，建立回歸方程y=79.186x+0.0005（r=0.9990）;經精密度、穩定性、加標回收率以及重現性等實驗證明，該方法可用于天麻多糖含量的測定。通過正交實驗研究昭通天麻多糖的超聲提取條件，并采用苯酚—硫酸法對多糖含量進行測定，超聲輔助提取的最佳提取條件組合為：提取溫度45℃，提取時間55min，料液比1∶35（g/mL）。

關鍵詞：天麻;多糖;苯酚—硫酸法

中圖分類號 S567.39文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）（02-03）-0028-03

Abstract：Phenol-sulfuric acid method was used to determine the content of polysaccharides in Gastrodia elata.The results showed that the absorbance at 490nm wavelength had a good linear relationship between the concentration of 0～0.0175mg/mL.The regression equation was established（y=79.186x+0.0005，r=0.9990）.The results of precision，stability，recovery rate and reproducibility experiments showed that the method could be used determination of polysaccharide content in Gastrodia elata.The extraction conditions of Polysaccharides from Gastrodia elata in Zhaotong were studied by orthogonal experiment.The content of polysaccharides was determined by phenol-sulfuric acid method.The results showed that the optimum extraction conditions were as follows：extraction temperature 45℃，extraction time 55 min，solid-liquid ratio 1：35 （g/mL）.

Key words：Gastrodia elata;Polysaccharide;Phenol-sulfuric acid method

天麻（Gastrodia elata Blume）屬蘭科多年生共生草本植物，為名貴的傳統中藥，至今已有近3000年的臨床應用歷史。天麻含有天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、香草醛、香草醇、派立辛、天麻多糖、多種氨基酸等有效成分，現代研究表明天麻具有鎮靜、催眠，抗驚厥，提高機體免疫力，改善記憶力等藥理作用[1]。近年來，隨著分子生物學技術的發展，多糖被認為是一類重要的信息分子。天麻多糖還具有抗氧化[2，3]、延緩細胞衰老[4]、減輕視網膜損傷、保護視網膜[5]、降血壓[6]、保肝[7，8]、抗腫瘤[9]等方面作用，因其毒副作用小、安全性強、功能多等特點而被越來越多的人所關注。

昭通是天麻主要產區之一，自然條件得天獨厚，所產天麻質量上乘，享譽國內外。筆者采用苯酚-硫酸法測定昭通天麻多糖的含量，通過正交實驗篩選天麻多糖的最佳提取條件，為昭通天麻的進一步開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 供試鮮天麻從昭通小草壩天麻種植田間采集。苯酚（國藥滬試），無水葡萄糖，無水乙醇，濃硫酸（南京化學試劑有限公司），以上試劑均為分析純;實驗用水為去離子水。

1.2 實驗儀器 UV759型紫外-可見光分光光度計（上海奧普勒儀器有限公司）;AX224ZH型電子天平（常州奧豪斯儀器有限公司）;0412-1型離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）;HWS-28型數顯恒溫水浴鍋（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）;SK5200LHC 超聲波洗滌器（上海科導超聲儀器有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 天麻預處理 鮮天麻采樣后立即回實驗室洗凈，蒸透，切片后55℃烘干，粉碎后過60目篩。取過篩的天麻干粉5g，按料液比1∶30加入80%乙醇，超聲浸提，除去天麻中的單糖、低聚糖、脂類、色素等成分，過濾后晾干、粉碎成天麻粉末備用。

1.3.2 標準曲線的繪制 精確稱取烘干至衡重的葡萄糖0.01g，加去離子水溶解后定容至100mL，配制成濃度為0.1mg/mL的對照品溶液待用。稱取5g苯酚加水定容至100mL，配制成濃度為5%的苯酚溶液待用。取8支具塞試管，分別準確量取葡萄糖對照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL至試管，并加水至溶液體積為2.0mL。在試管內分別加入1mL5%的苯酚溶液和5mL的濃硫酸，靜置10min后，放入沸水中水浴反應15min，取出冷卻至室溫。以加葡萄糖對照品溶液0.0mL的空白溶液作參比，在波長490nm處測量吸光度值，建立標準曲線。

1.3.3 天麻含量的測定方法 參照王韜[10]的方法并進行了修改。精確稱取1g預處理過的天麻粉樣品至錐形瓶中，按料液比1∶25加去離子水，35℃超聲提取20min，將溶液定容至100mL后過濾，取濾液10mL定容至100mL作為供試樣品溶液，參照1.3.2的方法測吸光度值，并按式（1）計算天麻多糖含量。

1.3.4 正交實驗設計 采用超聲輔助提取工藝提取昭通天麻多糖，為綜合考慮各因素對天麻多糖含量的影響，選取提取溫度、提取時間、料液比3個考查因素，設計3因素3水平正交實驗（見表1）。

2 結果與分析

2.1 繪制標準曲線 不同體積的對照品溶液在490nm處測得的吸光度值見表2，以葡萄糖對照品濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程：y=79.186x+0.0005（r=0.9990），表明該方程可用于昭通天麻多糖的含量測定。

2.2 精密度實驗 取0.5mL天麻多糖供試樣品溶液，按1.3.2的方法連續測定5次，測得天麻多糖溶液在490nm處吸光度值見表3，結果RSD=2.56%（n=5），表明精密度良好。

2.3 穩定性實驗 取天麻多糖供試樣品溶液0.5mL，按照1.3.2的方法，每隔0.5h測1次吸光度值，結果見表4，表明反應2.5h內溶液顯色穩定。

2.4 加標回收率實驗 取5支具塞試管，分別加入0.5mL天麻多糖供試溶液和0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL對照品溶液，補水至2mL，參照1.3.2的方法計算回收率。結果見表5。由表5可知，平均加樣回收率為100.50%，RSD為1.78%，表明本方法準確度較好，能測定天麻多糖的含量。

2.5 重現性實驗的測定 為考察測定方法的可靠性特設計重現性實驗，稱取同一批次的天麻粉參照1.3.2和1.3.3的方法進行處理，結果見表6，結果RSD=2.96%，表明該方法重現性良好。

2.6 天麻多糖超聲提取條件的優化 由表7可知，在超聲輔助提取天麻多糖的過程中，提取溫度對天麻多糖的提取率影響最大（R=12.46），其次為料液比，提取時間的影響最小。最優提取工藝為：提取溫度45℃，提取時間55min，料液比1∶35（g/mL）。

3 結論與討論

苯酚-硫酸法測定天麻多糖含量結果穩定、重現性強、操作方便，用于天麻多糖含量測定較為適合。在490nm波長處測定吸光度的回歸方程為y=79.186x+0.0005（r=0.9990）。正交實驗結果顯示，超聲輔助提取的最佳提取條件組合為：提取溫度45℃，提取時間55min，料液比1∶35（g/mL）。

目前天麻在全國多個地區廣泛種植，研究資料表明各地天麻的多糖差異較大，德江天麻多糖提取率最高達39.93%[11]，西藏天麻多糖提取率最高達33%[12]，陜西天麻多糖提取率最高達32.98%[13]，而本實驗研究結果顯示昭通天麻多糖提取率最高達42.29%。不同提取方法和測定方法對天麻多糖含量結果也有差異[10，14，15]，因此有必要建立統一的多糖檢測方法和完善的質量評價體系。同時天麻多糖含量高低與天麻品質之間的內在聯系也有待進一步研究。

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（責編：徐世紅）