賴氨酸特異性去甲基化酶1功能及與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展

陳江 李雪松 王子衛(wèi) 杜吉義 綜述 丁杰 審校

(畢節(jié)市七星關(guān)區(qū)人民醫(yī)院 普通外科，貴州 畢節(jié) 551700)

1942年，奧地利發(fā)育生物學(xué)家Waddington率先提出表觀遺傳學(xué)概念，認(rèn)為表觀遺傳是基因型產(chǎn)生表型的過程[1]。表觀遺傳學(xué)(epigenetics)是指在DNA序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)發(fā)生可遺傳的改變，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑以及非編碼RNA(Micro RNA)等。而組蛋白共價(jià)修飾作為一種重要的表觀遺傳模式，包括乙?；?acetylation)、磷酸化( phosphorylation)、甲基化(methylation)、泛素化(ubiquitination)、SUMO化(small ubiquitin-related modifier)、ADP-核糖基化(ADP-ribosylation)等[2]。人們對(duì)組蛋白的功能研究展開了廣泛的研究。我們針對(duì)組蛋白去甲基化酶賴氨酸特異性去甲基化酶1(LSDl)的結(jié)構(gòu)、功能以及在腫瘤領(lǐng)域的研究進(jìn)展作一綜述。

1 LSD1的結(jié)構(gòu)、功能

LSD1，胺氧化酶家族成員之一，也稱為KIAA0601、KDMl、AOF2、BHC110、p110b等，從酵母到人類均非常保守。Tower 結(jié)構(gòu)域和c 端的胺氧化酶結(jié)構(gòu)(amino oxidase like domain，AOL)。Tower結(jié)構(gòu)域是由從c端胺氧化酶結(jié)構(gòu)域向外伸出的兩個(gè)很長(zhǎng)的平行α螺旋形成，而胺氧化酶結(jié)構(gòu)域又包括黃素腺瞟呤二核苷酸(Flavin adenine dinulcleotide，F(xiàn)AD)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和催化活性中心兩個(gè)部分，它們是組蛋白底物的結(jié)合位點(diǎn)，在一級(jí)結(jié)構(gòu)中Tower結(jié)構(gòu)域把胺氧化酶結(jié)構(gòu)域分成兩個(gè)部分，通過Tower結(jié)構(gòu)LSD1能夠與其他蛋白，如CoREST蛋白相互作用，有研究報(bào)道通過重組缺失Tower 結(jié)構(gòu)的LSD1蛋白證實(shí)，Tower 結(jié)構(gòu)對(duì)LSD1的活性起著決定性的作用。FAD催化LSD1氧化反應(yīng)產(chǎn)生一個(gè)甲醛和一個(gè)去甲基化的賴氨酸殘基脫去甲基基團(tuán)，可以特異脫去組蛋白H3K4和組蛋白H3K9的二甲基和一甲基修飾，在體內(nèi)則可以去除H3K9的二甲基和一甲基修飾，調(diào)控靶基因的表達(dá)[3-4]。而H3K4三甲基修飾的去除則由另一類含有JmjC結(jié)構(gòu)域的蛋白家族完成，JmjC結(jié)構(gòu)域的蛋白家族依賴Fe(II)和α-酮戊二酸為輔因子催化氧化反應(yīng)去除甲基基團(tuán)，其家族成員可對(duì)H3K9、H3K27、H3K36 等多個(gè)位點(diǎn)行脫甲基化[5-6]。目前研究證實(shí)，H3K9、H3K27的甲基化修飾往往和基因轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)，而H3K4、H3K36和H3K79的甲基化修飾則常常促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄激活[7]。LSD1主要通過以下幾種方式來調(diào)控基因的表達(dá)：(1)CoREST的SANT2結(jié)構(gòu)域與靶基因作用后，H3K4脫甲基化，觸發(fā)轉(zhuǎn)錄抑制；(2)LSD1與AR/ER作用后，導(dǎo)致H3K9脫甲基化，觸發(fā)激活激素受體依賴的基因轉(zhuǎn)錄[8-9]；(3)LSD1作用H3K4的脫甲基化，使得DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的正調(diào)控因子DNMT3L能夠與未甲基化的K4位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)DNMTs的表達(dá)上調(diào)，造成DNA再甲基化(Denovomethylation)，最終觸發(fā)基因轉(zhuǎn)錄抑制[10]。

2 LSD1活性的調(diào)控

目前的研究表明，LSD1以組蛋白去乙?；笍?fù)合物的形式存在于體內(nèi)，CoREST、BHC80、HDAC1/2、BRAF等蛋白在此復(fù)合物中與LSD1形成共抑制復(fù)合物，從而精細(xì)地調(diào)控LSD1的活性[11]。LSD1不能以核小體作為底物，只有LSD1與含有SANT結(jié)構(gòu)域的RE-1元件輔助沉默因子(CoREST)結(jié)合后才能以核小體為底物使組蛋白上的H3K4Me去甲基化，CoREST與LSD1的結(jié)合能使LSD1不被蛋白酶水解，使LSD1趨于穩(wěn)定，并在與染色質(zhì)結(jié)合后招募LSD1[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，小類泛素修飾因子(SUMO)可與CoREST1的SIM結(jié)構(gòu)域相互作用后，上調(diào)LSD1活性，SUMO結(jié)合除去后，LSD1抑制調(diào)控的靶基因表達(dá)上調(diào)，靶基因啟動(dòng)子區(qū)的LSD1降低[14]。此外，組蛋白去乙?；刚{(diào)控著LSD1的組蛋白去甲基化酶活性，抑制組蛋白去乙?；钚院?，LSD1的去甲基化酶活性也被抑制，例如，組蛋白H3的過乙?；芤种芁SD1的去甲基化酶的活性，LSD1的活性也可以被H3K9的乙酰化顯著降低，并能被組蛋白H3第10位絲氨酸(H3S10)的磷酸化滅活[15]。一個(gè)組蛋白去乙?；笍?fù)合物中常常包含LSD1、CoREST以及BHC80復(fù)合體。在體外BHC80能抑制LSD1的組蛋白去甲基化酶活性，同時(shí)也能抑制細(xì)胞中LSD1-CoREST復(fù)合物的核小體去甲基化酶活性[16]。激活雄激素受體依賴的基因在LSD1與雄激素受體結(jié)合后開始表達(dá)，LSD1對(duì)H3K4的特異性因?yàn)樾奂に厥荏w改變?yōu)閷?duì)H3K9的特異性[17]。如在人的前列腺癌細(xì)胞中，雄激素受體依賴的基因表達(dá)因?yàn)長(zhǎng)SD1與雄激素受體相互作用而被激活，RNAi介導(dǎo)的LSD1基因敲除后，導(dǎo)致上調(diào)H3K9甲基化水平以及遏制相應(yīng)的雄激素受體依賴基因，證實(shí)LSD1能借助H3K9去甲基化而實(shí)現(xiàn)激活基因轉(zhuǎn)錄[18]。研究[19-20]證實(shí)，LSD1的活性也受到miR-137的調(diào)控。很多文獻(xiàn)已驗(yàn)證miR-137的靶基因包括LSD1、Cdc42等。在結(jié)腸癌中，miR-137被認(rèn)為是腫瘤抑制基因，miR-137的表達(dá)通常因?yàn)閱?dòng)子區(qū)域CpG島超甲基化修飾而被下調(diào)[21]。miR-137的下游靶基因LSDlmRNA的表達(dá)受到miR-137的抑制，轉(zhuǎn)染miR-137前體序列可以阻遏結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖[22]。另一方面，核受體TLX可以將LSD1招集至miR-137基因啟動(dòng)子區(qū)域，對(duì)miR-137的表達(dá)行負(fù)向調(diào)控，達(dá)成一個(gè)調(diào)控反饋通路[23]。

3 LSD1在腫瘤中的研究進(jìn)展

以前的觀點(diǎn)認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生是基于基因突變，但近年來研究證實(shí)，表觀遺傳機(jī)制在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。表觀遺傳機(jī)制的異?？烧{(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，LSD1也可以催化細(xì)胞內(nèi)非組蛋白去甲基化來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)生化過程。LSD1可通過催化抑癌蛋白p53羧基末端二甲基化的K370位點(diǎn)而使之脫甲基化，導(dǎo)致共激活蛋白53BP1的Tudor結(jié)構(gòu)域未能與K370位點(diǎn)作用，進(jìn)而阻止p53與53BP1相互結(jié)合，從而導(dǎo)致p53信號(hào)通路的傳遞中斷，調(diào)控著p53的生物學(xué)活性，使細(xì)胞增殖失控[24]。LSD1可能會(huì)因?yàn)槿笔?dǎo)致部分細(xì)胞停滯在G2/M期，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞相變和增值，提示著它的過表達(dá)可能會(huì)促進(jìn)腫瘤的形成[25]。研究[26]發(fā)現(xiàn)，Mi-2/核小體重組和脫乙?；笍?fù)合物(NuRD)的核心成分之一為L(zhǎng)SD1，與細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、轉(zhuǎn)移、侵襲相關(guān)的多種基因的啟動(dòng)子區(qū)域均可以和LSD1/NuRD復(fù)合物錨定，如E-cadherinsnail-slug-EMT以及腫瘤侵襲的關(guān)鍵信號(hào)通路TGF-β；該研究還發(fā)現(xiàn)，LSD1可抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力，LSD1反向調(diào)節(jié)TGF-β1信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程。研究發(fā)現(xiàn)，E-cadherin編碼基因CDH1的缺失或異常表達(dá)主要是通過EMT途徑實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。EMT在惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵的扳機(jī)作用，在EMT過程中上皮細(xì)胞失去自身特性與極性轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞類型。在此生物學(xué)過程中，細(xì)胞間粘附能力因?yàn)樯掀ぜ?xì)胞的成纖維細(xì)胞樣特性、細(xì)胞極性消失而減退[27]。同時(shí)E-鈣粘蛋白、角蛋白等上皮表型逐步喪失，而N鈣粘蛋白、波形蛋白等間質(zhì)表型表達(dá)增強(qiáng)[28]。啟動(dòng)EMT的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子有Snail、Slug.Twist、ZEB1、ZEB2等。Wnt/β-catenin、Notch、TGF-β、PI3K等EMT相關(guān)的信號(hào)通路在信號(hào)分子的作用下被激活，轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)豐度或活性相繼發(fā)生改變，啟動(dòng)EMT信號(hào)通路，隨之觸發(fā)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移生物學(xué)機(jī)制[29-32]。賴氨酸特異性去甲基化酶1(lysine-specific demethylase 1，LSD1)在轉(zhuǎn)錄因子Snail/Slug介導(dǎo)的EMT過程中扮演著必需的角色，LSD1的缺如，轉(zhuǎn)錄因子將不能抑制E鈣黏蛋白的表達(dá)，Snail/Slug無法獨(dú)立阻遏E-cadherin基因的表達(dá)，其對(duì)E-cadherin的抑制作用是通過LSD1對(duì)E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白的表觀遺傳修飾來實(shí)現(xiàn)的[33-35]。Snail/Slug蛋白分子可以靠N末端的SNAG分子掛鉤結(jié)構(gòu)，召集LSD1和CoREST形成的絡(luò)合物，與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域的E-box序列結(jié)合，來發(fā)揮LSD1的活性，脫去靶基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3K4的二甲基(H3K4me2)相一甲基(H3K4me)修飾，遏制靶基因的表達(dá)。E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)的可能因素包括CDH1基因突變、DNA甲基化修飾和CDH1基因突轉(zhuǎn)錄抑制[36-37]。針對(duì)LSD1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力影響的分子機(jī)制，多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌組織中LSD1呈現(xiàn)出高表達(dá)。 有學(xué)者開展了一系列前期研究，結(jié)果顯示，在108例結(jié)腸癌組織中LSD1的表達(dá)率明顯高于正常結(jié)腸粘膜上皮組織，陽性率高達(dá)66.7%。LSD1與結(jié)腸癌TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，LSD1高表達(dá)的結(jié)腸癌患者預(yù)后較差，由此推測(cè)LSD1在結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程中扮演了十分重要的角色[38]。丁杰等[39]進(jìn)行的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，靶向敲除LSD1基因能明顯抑制結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的增殖能力，使其侵襲性下降，增高細(xì)胞凋亡率；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在靶向沉默LSD1基因后，能下調(diào)SW620細(xì)胞中LSD1的mRNA及蛋白水平，而明顯上調(diào)E鈣黏蛋白的mRNA及蛋白水平，因此推測(cè)LSD1可能參與EMT途徑啟動(dòng)結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移。張?jiān)萚40]通過檢測(cè)52例結(jié)腸癌組織中LSD1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)LSD1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)率明顯高于癌旁組織；而且LSD1的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)，即分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等具有明顯相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，下調(diào)LSDl表達(dá)可以阻遏結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移能力。研究發(fā)現(xiàn)，LSD1抑制劑與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑共同在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116中使用，結(jié)果顯示單獨(dú)使用LSD1劑抑制后抑癌基因SFRP會(huì)再表達(dá)，兩者聯(lián)合使用則能夠明顯誘導(dǎo)已經(jīng)沉寂的抑癌基因SFRP2再表達(dá)[41]。P53及miR-137等抑癌基因在參與結(jié)腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移過程中仍具有重要地位，LSD1的活性受到miR-137的調(diào)節(jié)。在結(jié)腸癌細(xì)胞中，miR-137的表達(dá)因?yàn)閱?dòng)子區(qū)域CpG島超甲基化而下調(diào)，miR-137則靠下調(diào)LSD1的表達(dá)而間接阻遏結(jié)腸癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展[42]。LSD1對(duì)E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白的表觀遺傳修飾來實(shí)現(xiàn)對(duì)E-cadherin基因的抑制，破壞細(xì)胞黏附能力，推動(dòng)EMT的進(jìn)程，促進(jìn)了細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[43]。

4 LSD1抑制劑的研究進(jìn)展

根據(jù)與FAD相互作用的不同機(jī)制，LSD1抑制劑可分為兩大類別：不可逆型LSD1抑制劑及可逆型LSD1抑制劑。苯環(huán)丙胺及其衍生物為不可逆型LSD1抑制劑。此類化合物通過與FAD區(qū)域結(jié)合，形成環(huán)狀中間體形成不可逆轉(zhuǎn)的加合物；LSDl抑制劑不與FAD形成上述加合物形式則為可逆型，此過程可以發(fā)生逆轉(zhuǎn)。因?yàn)長(zhǎng)SD1與胺氧化酶結(jié)構(gòu)上同源，并且有45%的相同序列的催化區(qū)域[44]，這種結(jié)構(gòu)上的相似性使得人們開始針對(duì)MAO抑制劑對(duì)LSDl抑制作用進(jìn)行研究。Lee.MG等[45]研究發(fā)現(xiàn)，苯環(huán)丙胺(tranylcypromine，1)、優(yōu)降寧(pargyline，2)、苯乙肼(phenelzine，3)等MAO抑制劑能夠抑制LSD1活性，但由于抑制活性較小，選擇性差等原因，不能用作特異性的LSD1抑制劑。在此結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，一系列選擇性更好的具有苯環(huán)丙胺骨架的衍生物被開發(fā)，Ueda等[46]設(shè)計(jì)特異性更強(qiáng)的化合物5、6其對(duì)LSD1的抑制活性比苯環(huán)丙胺提高了400～1 100倍；并且該研究團(tuán)隊(duì)還設(shè)計(jì)并合成了N-烷基化的化合物7，酶抑制活性提高了6倍[47]。

由于LSD1能夠識(shí)別組蛋白 H3N 端21個(gè)氨基酸多肽，2010年Culhane等[48]設(shè)計(jì)并合成了一系列多肽類LSD1抑制劑，發(fā)現(xiàn)非時(shí)間依賴性LSD1抑制劑—多肽化合物1，IC50值為(15.6士1.7)。Kakizawa等[49]根據(jù)組蛋白 H3上的氨基酸序列，設(shè)計(jì)了對(duì)LSD1具有選擇性抑制作用的一類含有苯環(huán)丙胺結(jié)構(gòu)的21肽，化合物22(IC50= 0.148 μmol·L-1)顯示了最強(qiáng)的抑制效果。Tortorici等[50]基于Snail的氨基酸序列設(shè)計(jì)了能競(jìng)爭(zhēng)性抑制LSD1活性的具有6個(gè)氨基酸的小肽，而且具有抗增殖效應(yīng)。

Sorna等[51]通過高通量虛擬篩選的方法獲取了一類具有苯甲酰肼結(jié)構(gòu)的強(qiáng)效LSD1抑制劑，通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化設(shè)計(jì)并合成了具有很強(qiáng)LSD1抑制活性的化合物34(IC50= 13 nmo1·L-1)，能可逆并特異性地與LSD1結(jié)合，對(duì)乳腺癌和結(jié)直腸癌細(xì)胞系具有顯著抗增殖作用。運(yùn)用傳統(tǒng)小分子化合物調(diào)控LSD1的活性來調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展是目前LSD1抑制劑研究的熱點(diǎn)方向。但現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的LSD1抑制劑對(duì)酶的抑制選擇性及活性較差，因此，設(shè)計(jì)合成高效、高選擇性小分子LSD1抑制劑成為今后研究的目標(biāo)。