應(yīng)用噬菌體治療畜禽細(xì)菌性腹瀉的研究進(jìn)展

王通，李曉宇,2,4，王麗麗,2,4，李淑英，徐永平.*

(1 大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院, 大連 116024；2 動(dòng)物性食品安全保障技術(shù)教育部工程研究中心, 大連 116600；3 大連賽姆生物工程技術(shù)公司, 大連 116620；4 遼寧省大連賽姆噬菌體應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，大連 116600)

1 引言

養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展關(guān)系到每個(gè)人的飲食安全與身體健康。在我國(guó)，規(guī)模化養(yǎng)殖已成為畜禽養(yǎng)殖的最主要形式，這也增加了畜禽疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)。其中，細(xì)菌性疾病是影響?zhàn)B殖業(yè)發(fā)展的主要問(wèn)題之一，每年投入人力、藥物等成本巨大，為養(yǎng)殖戶(hù)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。

畜禽腹瀉是養(yǎng)殖過(guò)程中的一種常見(jiàn)病癥，通常與腸道疾病或其他全身性疾病相關(guān)。除腸道細(xì)菌感染造成的腹瀉之外，常見(jiàn)病因還有動(dòng)物中毒、寄生蟲(chóng)感染、營(yíng)養(yǎng)問(wèn)題、應(yīng)激及神經(jīng)性因素等。治療畜禽腹瀉要對(duì)癥下藥，根據(jù)病因找到最合適的治療方法。其中由大腸埃希菌(Escherichia coli)、沙門(mén)菌(Salmonella)等病原菌造成腸道疾病引起的腹瀉最為常見(jiàn)[1]。養(yǎng)殖過(guò)程中飼料加工、籠舍清理、溫度調(diào)節(jié)等方面處理不當(dāng)都可為病菌傳播提供條件。動(dòng)物染病后發(fā)生腹瀉常伴有食欲不振、生長(zhǎng)緩慢等問(wèn)題，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡。疾病傳播可導(dǎo)致減產(chǎn)，對(duì)畜牧業(yè)發(fā)展造成嚴(yán)重影響。常用的抗生素療法存在藥物殘留、致病菌出現(xiàn)耐藥性等諸多弊端，因此找到一種合適的替代療法已經(jīng)迫在眉睫[2]。噬菌體療法憑借無(wú)殘留、成本低等多方面優(yōu)勢(shì)成為一種潛在的替代選擇，本文就噬菌體防治畜禽腹瀉研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述。

2 噬菌體簡(jiǎn)介

噬菌體(bacteriophage)于1915年由英國(guó)細(xì)菌學(xué)家Twort (1877-1950)和加拿大生物學(xué)家Félix d'Herelle發(fā)現(xiàn)，是對(duì)一類(lèi)能感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱(chēng)[3]。噬菌體能特異性結(jié)合、裂解宿主，根據(jù)噬菌體與宿主的關(guān)系，可將其分為溫和噬菌體和裂解性噬菌體兩大類(lèi)。裂解性噬菌體增殖周期短，每次裂解宿主都可產(chǎn)生多達(dá)200個(gè)子代噬菌體，具有極高的增殖效率[4]。利用這種裂解效應(yīng)來(lái)特異性殺滅病原菌，具有極高的精確性，治療效果也十分顯著[5]。一般而言，致病菌對(duì)噬菌體的抗性突變率很低，頻率約為10-7，而對(duì)抗生素的抗性突變頻率為10-6，噬菌體可以在病原菌產(chǎn)生抗性之前將其有效殺滅。此外，噬菌體療法不存在藥物殘留問(wèn)題，也不會(huì)污染畜禽產(chǎn)品[6]。憑借其多方面優(yōu)勢(shì)，噬菌體成為一種抗生素理想的替代品。

3 噬菌體治療畜禽腹瀉

3.1 防治大腸埃希菌引起的腹瀉

大腸埃希菌屬革蘭陰性細(xì)菌，廣泛分布于人畜的腸道環(huán)境里。多數(shù)大腸埃希菌是非致病性的，但部分致病性大腸埃希菌能夠引起腸道內(nèi)外部感染。致病性大腸埃希菌是一類(lèi)常見(jiàn)的、能夠引起畜禽腸道疾病的病原菌。研究人員根據(jù)致病機(jī)理的不同將致瀉性大腸埃希菌主要分為6類(lèi)：產(chǎn)腸毒性大腸埃希菌(EnterotoxigenicE.coli, ETEC)、腸出血性大腸埃希菌(EnteropathogenicE.coli, EHEC)、腸粘附性大腸埃希菌(EnteroadhesiveE.coli, EAEC)、腸致病性大腸埃希菌(EnteropathogenicE.coli, EPEC)、腸侵襲性大腸埃希菌(EnteroinvasiveE.coli, EIEC)和擴(kuò)散粘附性大腸埃希菌(Diffusely adherent E.coli, DAEC)。作者所在團(tuán)隊(duì)(付麗娜，2017)對(duì)于各類(lèi)致病性的大腸埃希菌的噬菌體治療進(jìn)行過(guò)研究[7]，并成功分離出了豬源腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌噬菌體。牛羊等反芻動(dòng)物是食源性大腸埃希菌感染的重災(zāi)區(qū)，而幼年動(dòng)物比成年動(dòng)物更易受到感染。幼畜中最常見(jiàn)的大腸埃希菌病是由非侵入性腸毒素大腸埃希菌(ETEC)引起的，也是腹瀉的主要原因之一。患病嚴(yán)重時(shí)會(huì)伴有出血性腹瀉等癥狀，是導(dǎo)致幼畜死亡的主要威脅之一。

國(guó)內(nèi)外對(duì)利用噬菌體治療致病性大腸埃希菌引起的畜禽腸道疾病都進(jìn)行了廣泛的研究，作者所在團(tuán)隊(duì)(牛冬燕，2009)對(duì)應(yīng)用噬菌體控制牛及其飼養(yǎng)環(huán)境中大腸埃希菌O157:H7進(jìn)行充分研究，利用wV7、wV8、rV5和wV11共四種噬菌體對(duì)牛場(chǎng)中大腸埃希菌O157:H7進(jìn)行裂解，研究表明，口服給藥的四株噬菌體可以有效裂解大部分受檢菌株，不同飼養(yǎng)場(chǎng)的菌株對(duì)噬菌體wV8表現(xiàn)出不同的易感性，發(fā)現(xiàn)噬菌體rV5、wV11和wV8的易感性受其噬菌體表型和PFGE基因型影響，而噬菌體wV7的宿主譜和裂解能力不受菌株的噬菌體表型和PFGE基因型的影響，能夠有效地裂解所有受檢分離株[8]。Callaway等[9]從飼育場(chǎng)的環(huán)境中篩選得到了針對(duì)大腸埃希菌O157:H7的噬菌體，利用其治療綿羊的大腸埃希菌感染，24h后發(fā)現(xiàn)羊體內(nèi)和糞便中的大腸埃希菌數(shù)量顯著下降。Cha等[10]檢測(cè)特異性噬菌體CJ12治療ETEC感染的效果，他們將噬菌體混入豬飼料中給藥，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的豬糞便中的ETEC數(shù)量減少了63.92%和60.73%。Rozema等[11]分別通過(guò)口服和注射給藥的方式利用噬菌體治療大腸埃希菌O157，都取得了良好的治療效果。Denou等[12]利用T4噬菌體對(duì)感染大腸埃希菌O157:H7的小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，治療效果過(guò)十分顯著，且未造成任何不良反應(yīng)。Li等[13]利用噬菌體治療大腸埃希菌造成的腹瀉，將大腸埃希菌接種到小鼠體內(nèi)，經(jīng)噬菌體治療三周后，所有小鼠全部存活。利用噬菌體治療染病的肉雞，顯著的降低了肉雞的死亡率，且肉雞增重明顯。飼料的利用率提高了11%，飼料的消耗量也大幅降低。說(shuō)明在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，利用噬菌體治療大腸埃希菌引發(fā)的腸道疾病，能有效地降低養(yǎng)殖成本。Lau等[14]利用噬菌體EC1治療大腸埃希菌O78：K80導(dǎo)致的肉雞腹瀉，在三周的試驗(yàn)過(guò)后，肉雞死亡率從83.3%下降至13.3%。Huff等[15]利用噬菌體治療大腸埃希菌導(dǎo)致的肉雞腹瀉，實(shí)驗(yàn)將感染大腸埃希菌后不進(jìn)行處理的肉雞與應(yīng)用噬菌體進(jìn)行治療的肉雞進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示，未經(jīng)噬菌體治療的一組肉雞死亡率高達(dá)47%，而應(yīng)用噬菌體進(jìn)行治療的一組，其死亡率降低至13%。證明噬菌體在治療家禽大腸埃希菌腹瀉上效果十分顯著。El-Gohary等[16]將噬菌體噴灑到褥草上來(lái)抑制大腸埃希菌的擴(kuò)散，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)噬菌體處理的肉雞受大腸埃希菌影響極低，生長(zhǎng)迅速，且其食用安全性未受到影響。

3.2 防治沙門(mén)菌引起的腹瀉

沙門(mén)菌是一類(lèi)常見(jiàn)的革蘭陰性菌，在自然界中分布十分廣泛，營(yíng)養(yǎng)需求較低，種類(lèi)繁多，目前已檢測(cè)出沙門(mén)菌血清型2500余種[17]。沙門(mén)菌作為一類(lèi)常見(jiàn)的食源性致病菌，通常能夠誘發(fā)腸道疾病，養(yǎng)殖業(yè)中主要感染對(duì)象為家禽，除造成畜禽患病以外，還可能通過(guò)污染動(dòng)物制品感染人類(lèi)，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致食物中毒。家禽感染后，種蛋的孵化率、育雛率和成活率會(huì)都受到嚴(yán)重影響，給養(yǎng)殖戶(hù)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

常見(jiàn)的沙門(mén)菌病有雞白痢、雞傷寒和雞副傷寒等。其中最為常見(jiàn)的是雞白痢，雞白痢是雛雞的一種急性、敗血性傳染病[18]。2周齡以?xún)?nèi)的雛雞發(fā)病率和死亡率都很高，成年雞感染沙門(mén)菌則多表現(xiàn)為慢性癥狀。沙門(mén)菌可以進(jìn)行水平傳播也可以進(jìn)行垂直傳播，大多通過(guò)帶菌種雞垂直傳播給雛雞，也可以通過(guò)糞便水平傳播。如果孵化了帶菌的雞蛋，雛雞出殼1周內(nèi)就可能發(fā)病死亡，對(duì)于雛雞的成活率影響極大。育成期雖有感染，但一般無(wú)明顯臨床癥狀，種雞場(chǎng)一旦被污染，很難根除。

研究表明利用噬菌體治療家禽沙門(mén)菌感染導(dǎo)致的腹瀉效果十分顯著，作者所在團(tuán)隊(duì)成員(袁玉玉，2016)[19]曾對(duì)應(yīng)用噬菌體治療沙門(mén)菌導(dǎo)致的雞白痢進(jìn)行過(guò)研究，分離得到強(qiáng)裂解性噬菌體，通過(guò)滴眼和口服方式給藥，分組實(shí)驗(yàn)中治愈率最高可達(dá)80%。Atterbury[20]等研究發(fā)現(xiàn)，利用高濃度的噬菌體制劑能有效的減少肉雞腸道沙門(mén)菌和鼠傷寒沙門(mén)菌在肉雞腸道內(nèi)的數(shù)量。且盡管會(huì)出現(xiàn)部分噬菌體抗性突變菌，但在體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)其抗性持續(xù)時(shí)間較短，因而總體上噬菌體治療效果十分顯著。另一項(xiàng)研究表明，向蛋雞基礎(chǔ)日糧中添加針對(duì)雞沙門(mén)菌、雞白痢沙門(mén)菌、鼠沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌、腸炎沙門(mén)菌、德比沙門(mén)菌和金黃色葡萄球菌的混合噬菌體。可使蛋雞盲腸內(nèi)容物內(nèi)沙門(mén)菌數(shù)量直線下降，且未觀察到噬菌體作為飼料添加劑對(duì)蛋雞的產(chǎn)蛋性能的不良影響。此外，噬菌體還能減弱種蛋孵化過(guò)程中的沙門(mén)菌感染[21]。Henriques等[22]向孵化過(guò)程中感染沙門(mén)菌的蛋殼表面噴灑噬菌體后發(fā)現(xiàn)，噴灑組中孵化的雛雞與未噴灑組中相比關(guān)節(jié)炎癥狀明顯減輕，且8d后癥狀消失，與未感染沙門(mén)菌種蛋孵化的雛雞狀態(tài)相似。這說(shuō)明噬菌體可以阻斷沙門(mén)菌的垂直傳播。

3.3 治療途徑

噬菌體是替代抗生素的理想選擇，而在畜禽大規(guī)模養(yǎng)殖過(guò)程中，出于成本等多方面考慮，將噬菌體制劑混入飼料中給藥是最為常見(jiàn)的方法[23]。研究中發(fā)現(xiàn)將噬菌體混入飼料中直接飼喂的治療效果并不理想，其原因在于通過(guò)消化道到達(dá)胃腸道過(guò)程中，噬菌體可能會(huì)受到飼料成分、各類(lèi)雜質(zhì)、胃酸等外界條件的影響而導(dǎo)致其活性下降甚至喪失活性[24]。因此，要保證口服噬菌體治療動(dòng)物胃腸道疾病的療效，就必須找到一種能保護(hù)噬菌體不受到破壞，在給藥過(guò)程中保持噬菌體活性的方法[25]。作者所在團(tuán)隊(duì)(馬永生，2011)開(kāi)發(fā)了一種噬菌體口服微球制劑，利用海藻酸鈉、乳清蛋白為載體材料，利用二甲金屬陽(yáng)離子鈣為固化劑制成微球制劑能夠有效地保護(hù)噬菌體免受胃酸和消化酶作用而遭到破壞。使得噬菌體可以到達(dá)動(dòng)物腸道并有效地釋放，直達(dá)病灶充分發(fā)揮作用，保證了噬菌體治療的快速、高效[26]。Colom等[27]利用脂質(zhì)體包被噬菌體，治療家禽沙門(mén)菌感染，72h后膠囊化給藥的噬菌體在動(dòng)物體內(nèi)仍存在38.1%，而未經(jīng)包被給藥的噬菌體，只剩9.5%，其對(duì)噬菌體的保護(hù)作用突出。Kaikabo等利用殼聚糖制成包被噬菌體的微粒治療肉雞大腸埃希菌感染，肉雞死亡率從58.33% 降低至16.7%，噬菌體的保存率從42%提高至83.33%，充分說(shuō)明口服給藥過(guò)程中對(duì)噬菌體進(jìn)行包裝加工的重要性。這種新型的噬菌體制劑為噬菌體療法在畜牧業(yè)中的推廣應(yīng)用開(kāi)辟了的道路。

4 結(jié)論與展望

抗生素耐藥性已經(jīng)成為公共衛(wèi)生領(lǐng)域的世界性問(wèn)題，開(kāi)發(fā)新抗生素的成本高、周期長(zhǎng)等多方面問(wèn)題都讓人們不得不加緊尋找一種合適的替代品[28]。國(guó)內(nèi)外的大量實(shí)驗(yàn)證明，利用噬菌體來(lái)防治由細(xì)菌感染造成的畜禽腹瀉是安全有效的[29]。噬菌體在自然界含量豐富，分布廣泛。與傳統(tǒng)的藥品相比，噬菌體的開(kāi)發(fā)周期更短，成本低廉。通過(guò)簡(jiǎn)單的篩選、離心去除細(xì)菌碎片即可得到相對(duì)純凈的噬菌體儲(chǔ)存運(yùn)輸條件寬松，一般常溫即可。利用噬菌體治療疾病的常見(jiàn)方法，除將噬菌體直接作為抗菌劑，也可將噬菌體編碼的裂解酶作為抗菌劑以及從噬菌體的裂解機(jī)制出發(fā)，尋找新的藥物靶點(diǎn)，通過(guò)多種途徑發(fā)揮噬菌體的功能，使其效用最大化。噬菌體所具有的高度特異性使其在發(fā)揮作用的同時(shí)不會(huì)對(duì)機(jī)體內(nèi)的固有菌群產(chǎn)生影響，也不會(huì)干擾機(jī)體的正常代謝。相較于抗生素，病菌對(duì)噬菌體產(chǎn)生抗藥性的幾率非常低，因而將噬菌體制劑產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用到治療畜禽腹瀉以及其他的常見(jiàn)疾病中潛力十分巨大。根據(jù)近年來(lái)的經(jīng)驗(yàn)以及應(yīng)用方面的成果，越來(lái)越多的科學(xué)家和企業(yè)都相信，噬菌體用于替代抗生素治療細(xì)菌性疾病的應(yīng)用將會(huì)取得巨大的成功。此外，當(dāng)代生物醫(yī)學(xué)技術(shù)發(fā)展突飛猛進(jìn)，各種新的培養(yǎng)檢測(cè)方法也層出不窮，在此基礎(chǔ)上人們對(duì)噬菌體的生物學(xué)特性以及噬菌體與其宿主菌的相互作用機(jī)制也有了更深層的研究，這樣更有利于研制出新的噬菌體制劑及為噬菌體治療提出科學(xué)可行的策略，預(yù)防和治療細(xì)菌感染。

雖然噬菌體療法有諸多優(yōu)勢(shì)，但在其實(shí)際應(yīng)用過(guò)程仍存在諸多不足，例如噬菌體裂解譜過(guò)窄、裂解病菌后其釋放內(nèi)毒素等都影響了噬菌體療法的進(jìn)一步推廣。因而篩選廣譜噬菌體、根據(jù)實(shí)際需要通過(guò)基因工程技術(shù)對(duì)現(xiàn)有噬菌體進(jìn)行改造成為了其發(fā)展的趨勢(shì)，由于噬菌體是通過(guò)其內(nèi)部含有的多種酶類(lèi)發(fā)揮作用，因此對(duì)其所含的酶加以提純利用也是噬菌體研究發(fā)展的趨勢(shì)之一。隨著對(duì)噬菌體分子機(jī)理層面研究的不斷深入，相信在不遠(yuǎn)的將來(lái)，噬菌體療法會(huì)為養(yǎng)殖業(yè)乃至人類(lèi)的健康做出更大的貢獻(xiàn)。