噬菌體在飼料中的應用及研究進展

袁玉玉 ，叢聰，渠坤麗，李曉宇,2,4，王麗麗,2,4，李淑英，徐永平,,*

(1 大連理工大學生命科學與技術學院，遼寧大連 116024；2 動物性食品安全保障技術教育部工程研究中心，遼寧大連 116600；3 大連賽姆生物工程技術公司, 遼寧大連 116620；4 遼寧省大連賽姆噬菌體應用工程技術研究中心，遼寧大連 116600)

1 前言

畜牧業抗感染藥物是目前全球最大市場之一，全球每年用于禽畜養殖業的抗生素約為抗生素消耗總量的50%，近20年來由于抗生素濫用導致的耐藥菌和抗生素殘留等問題日益嚴重。據調查，給動物使用的抗生素中約75%沒有被完全消化，最終進入環境[1]，這些抗生素可隨食物鏈進入人體。自2006年歐洲禁止在動物飼料中使用抗生素作為生長促進劑以來，大量已經發表的研究描述了抗生素替代品的各種策略，以促進畜禽生長及預防疾病[2]。在這些替代品中，噬菌體被認為是抗生素生長促進劑的合適替代品，受到了極大的關注[3]。

2 噬菌體應用于禽類飼料

多年來，沙門菌被歐盟認定為第二常見食源性致病菌[4]，由沙門菌引起的人類胃腸道疾病是一項重要的公共衛生問題，生產性動物(Production animals)已被確定為人畜共患腸道致病菌(包括沙門菌)的重要來源。抗生素對減少家禽的沙門菌起重要作用，但近年來，公眾意識到動物性產品是耐藥菌產生的重要源頭，家禽生產商對用于飼料中的抗生素替代品越來越感興趣[5]。Kim等[6]進行了噬菌體飼喂實驗，將腸炎沙門菌噬菌體添加至基礎日糧中；實驗數據顯示，噬菌體組雞的肝脾、腹部脂肪和胸部肌肉的相對重量比其他組略高，雞死亡率和盲腸腸炎沙門菌濃度都隨噬菌體濃度增加而呈線性下降趨勢(P＜0.05)。整體研究結果表明，噬菌體可減少腸炎沙門菌感染雞的死亡率，且對雞的生長和肉類產品不會產生負面影響。Lim[7]等從污水中分離出寬裂解譜沙門菌噬菌體，并將該噬菌體作為飼料添加劑飼喂給雛雞；數據顯示，109PFU/g噬菌體組中70%的雞沒有被檢測出腸道沙門菌。研究表明，噬菌體治療可有效防止腸炎沙門菌的水平傳播。另外，Lim等還研究了雞沙門菌特異性噬菌體在飼料中的應用。以6周齡的雞為實驗對象，攻菌后3周，觀察死亡率，定期從肝臟、脾臟和盲腸中分離雞沙門菌。結果顯示，飼喂噬菌體組雞的器官中再分離雞沙門菌減少、死亡率顯著下降(P＜ 0.05)[8]。Joan等將沙門菌噬菌體包封在脂質體中，該制劑可以在4℃下儲存至少3個月，并且可以加入飲用水和動物飼料[9]。

人彎曲菌病是一種急性細菌性腸炎，被認為是全球性公共衛生問題，而雞肉是人彎曲菌病的重要來源之一。Carvalho等將用摻入噬菌體雞尾酒的飼料飼喂實驗雞，每隔一段時間收集所有雞的糞便，對空腸彎曲桿菌和噬菌體進行計數。實驗結果顯示，通過飼料飼喂的噬菌體可以在雞體內復制，從而減少雞空腸彎曲桿菌菌群。產氣莢膜梭菌是一種產芽孢厭氧菌，該菌是最常見的人類食源性病原菌之一[10]，也是壞死性腸炎主要病因之一，因此產氣莢膜梭菌在養禽業是經濟重要型禽病原菌[11,12]。Miller等研究了噬菌體雞尾酒在控制產氣莢膜梭菌壞死性腸炎中的效用；結果證明，噬菌體通過口服灌胃、飼料或飲水都可以顯著降低雞的死亡率(P＜ 0.05)，雞的增重和飼料轉化率都顯著好于對照組。實驗數據表明，通過飲水或飼料給予肉雞噬菌體INT-401可能會有效控制產氣莢膜梭菌引起的壞死性腸炎，也可能會改善臨床或亞臨床壞死性腸炎雞的增重和飼料轉化率[13]。

另外，也有關于通過添加性噬菌體提高雞生產性能的報道。Zhao等通過實驗證明添加性噬菌體對蛋雞產蛋量、蛋清和糞便菌群濃度、蛋品質、糞便菌群和含水量的影響；數據顯示，噬菌體組(日糧中添加噬菌體)蛋雞產蛋量比基礎日糧組更高(P＜0.05)，且噬菌體濃度越大，蛋雞產蛋量越高；與基礎日糧組相比，噬菌體組蛋雞排泄物中大腸埃希菌和沙門菌濃度下降(P＜0.05)[14]。Wang等評估了飼料中添加噬菌體對肉雛雞生長性能、血液特征、器官相對重量、胸肌質量和糞便微生物的影響；整個試驗過程中，雛雞體增重和采食量并沒有受到飲食質量的影響。結果顯示，噬菌體組(日糧中添加噬菌體)雛雞的相對肝重增加(P＜0.05)，該組雛雞的乳酸菌數目比基礎日糧組和抗生素組(日糧中添加抗生素)高(P＜0.05)。另外，一些病原菌也受到噬菌體的抑制[15]。

這些結果為預防和控制雞沙門菌感染提供重要策略，也表明噬菌體可減少沙門菌食物中毒的發生率。噬菌體可能是預防禽細菌性感染的一種新型、安全、合理有效的抗生素替代品。

3 噬菌體應用于豬飼料中

根據歐洲食品安全局/歐洲疾病管制局最新報道，豬肉及其相關產品作為人畜共患病的載體，成為與人類沙門菌病最相關的肉類[16]。另外，耐藥菌的產生既給養豬業帶來巨大經濟損失又威脅人類健康，噬菌體無疑成為控制豬細菌性疾病強有力的候選者。

Saez等檢測微囊化噬菌體雞尾酒通過飼料飼喂時是否能保持治療效果；實驗豬隨機分為3組：飼料組、口服組和對照組；結果顯示，與口服組和對照組相比，飼料組豬的沙門菌脫落更少；飼料組豬回腸和盲腸內容物的鼠傷寒沙門菌濃度比對照組更小，在飼料組和口服組回腸和盲腸內容物中檢測到高濃度的沙門菌噬菌體[17]。CHA等的研究證明，產腸毒素大腸埃希菌特定裂解性噬菌體CJ12在實驗期間沒有產生任何副作用，可以作為飼料添加劑。本實驗噬菌體組豬飼喂混合飼料(噬菌體與飼料比例為1:1000)，初次攻菌后d3，噬菌體組對產腸毒素大腸埃希菌感染性腹瀉表現出比對照組更強的抗性。噬菌體組糞便產腸毒素大腸埃希菌數量比對照組平均低62.32%，且在噬菌體組中成功從糞便中分離出噬菌體[18]。Lee等研究了膳食補充性噬菌體對感染產腸毒大腸埃希菌K88斷奶仔豬的治療作用。仔豬平均日增重、糞便一致性評分、空腸大腸埃希菌粘附評分、血清腫瘤壞死因子-α濃度、結腸食糜pH值、回腸和結腸杯狀細胞密度和回腸絨毛高度與隱窩深度比測評結果顯示，噬菌體組仔豬的大腸埃希菌感染狀況顯著緩解(P＜ 0.10)?？傮w而言，噬菌體性日糧添加劑可有效緩解斷奶仔豬ETEC K88急性感染癥狀[19]。

關于噬菌體提高豬生產性能的研究也有相關報道：

Hosseindoust等調查了在不同環境中噬菌體對斷奶仔豬生長性能、消化性能、回腸和盲腸的微生物群、腸道形態及免疫力的影響。結果顯示，衛生環境中，噬菌體組(日糧中含有噬菌體)仔豬盲腸(P＜0.01)和回腸(P＜0.05)梭狀芽孢桿菌、回腸大腸埃希菌群(P＜0.01)的數量減少。噬菌體組仔豬回腸乳酸菌和盲腸雙歧桿菌增加，回腸雙歧桿菌也有增加趨勢(P= 0.08)。污染環境降低了回腸乳酸菌(P=0.08)和盲腸雙歧桿菌(P= 0.08)的增加率[20]。

Kim等研究了噬菌體、益生菌和噬菌體加益生菌作為膳食補充劑對斷奶仔豬生長性能和腸道健康的影響。將200只斷奶仔豬隨機分為基礎日糧組、基礎日糧+益生菌發酵產品組、基礎日糧+噬菌體雞尾酒組和基礎日糧+益生菌發酵產品+噬菌體雞尾酒組。結果顯示，飼喂噬菌體的仔豬的整體平均日增重、增益與進給比、糞便評分都有所增加，仔豬大腸菌群和梭狀芽孢桿菌減少，益生菌的增益比和回腸中的乳酸菌顯著增加。目前的研究結果表明，噬菌體雞尾酒有增強斷奶仔豬生長性能和腸道健康的潛力，但與益生菌組合并沒有顯示相互作用[21]。

Yan等研究了噬菌體作為飼料補充對生長豬生產性能的影響；結果表明，與比飼喂基礎日糧組的豬相比，飼喂補充性噬菌體組豬的氮消化率和干物質消化率都較高(P＜0.05)；另外，觀察治療中豬的紅細胞、白細胞、淋巴細胞濃度和糞便中的水分，結果是無顯著性差異(P＞0.05)；研究表明，在生長豬中，0.5g/kg的噬菌體可作為抗生素替代品[22]。

4 噬菌體水產養殖業飼料中的應用

集約化的水產養殖方式增加了細菌性疾病發生率，給水產養殖業帶來巨大損失?，F有消毒技術(過濾、臭氧、紫外線等)無法為水產養殖場提供無菌的環境[23]。同時，隨著一些經濟型重要病原體的進化抗性，抗生素的使用越來越過時，人們開始研究一些環境友好型的解決方法，噬菌體作為抗生素替代品越來越受到關注。到目前為止，噬菌體已經被應用于眾多魚類細菌性疾病的防治，并取得積極的結果[24,25]。

Park等評價了噬菌體浸漬飼料后對香魚變形假單胞菌感染的治療作用；實驗發現短尾噬菌體PPp-W4的治療效果好于肌尾噬菌體PPpW-3，且兩株噬菌體混合后的作用效果更好。噬菌體PPpW-3/W-4飼喂組和對照組香魚死亡率分別為20.0%和93.3%。魚池現場試驗中，在自然感染變形假單胞菌的魚池中添加PPpW-3/W-4浸泡的飼料，發現魚的死亡率以恒定每日5%的速率下降到1/3。在長期飼喂含噬菌體飼料的健康魚腎臟中發現噬菌體，且該魚的身體里沒有變形假單胞菌；從這些結果可以發現，噬菌體浸泡飼料具有控制細菌性疾病的潛力[26]。

另外，Park等認為噬菌體是細菌性疾病控制的候選藥物。他們分離了兩株變形假單胞菌噬菌體，將噬菌體浸漬的飼料口服施用以保護實驗性感染變形假單胞菌的香魚；實驗結果顯示，在使用噬菌體的魚的腎臟中能檢測到噬菌體，且病原菌消失；在噬菌體存在的情況下淡水中的細菌數量明顯下降，而噬菌體的數量快速增加[27]。

5 展望

綜上所述，噬菌體作為飼料添加劑不僅可以限制抗生素的使用，更能作為益生菌和抗生素的輔助治療劑。值得注意的是，噬菌體在提高動物生產性能方面也起到一定作用，筆者分析，原因在于噬菌體可以防控細菌性疾病，因而避免了細菌感染對動物生長造成的影響，最終的結果是動物生產性能有所提高。噬菌體作為抗生素替代品來防控細菌性疾病是備受關注的研究方向，隨著科研人員對噬菌體深入的研究，噬菌體作為飼料添加劑必定會為畜牧和水產養殖業的健康穩定可持續發展做出重要貢獻。