Fenton氧化對微生物群落結構和功能基因的影響

高春陽 張 羽 張坤峰 于文赫 杜顯元 鄭 瑾 韓占濤

(1.中國地質科學院水文地質環境地質研究所；2.中國地質大學(北京) 3.中國石油集團安全環保技術研究院有限公司；4.石油石化污染物控制與處理國家重點實驗室)

0 引 言

石油被廣泛應用于生產及生活的各個領域，包括工業、農業、交通運輸業等，素有工業“血液”之稱，目前，全球石油總產量超過30億t[1-3]。然而，在石油的開采以及運輸等過程中出現的“跑、冒、滴、漏”等現象常導致其進入土壤和地下水進而造成污染[4-5]。石油是由烷烴、環烷烴、芳香烴等組成的混合物，具有高黏度、低流動性、低揮發性和低生物降解性等特點，一旦進入土壤和地下水將很難通過土壤和地下水的自我凈化能力去除[6]。現有石油類污染土壤的修復方法大體包括物理法、化學法和生物法[7-11]。其中化學氧化法具有修復污染物范圍廣、修復周期短、氧化劑易得等優點，是目前處理地下水、沉積物和土壤石油污染的主流方法[12]。

化學氧化技術中常用的化學藥劑包括O3、KMnO4、Na2S2O8和Fenton試劑等，其中Fenton試劑因其氧化后不產生其他副產物而被廣泛應用[13]。在高濃度石油烴污染土壤修復中通常采用化學氧化技術作為預處理將高濃度的石油烴降低為低濃度的石油烴，然后再采用微生物技術或自然監測法進行后續修復[14]。然而，化學試劑不僅能降解石油烴同時也是一種殺菌劑，在氧化過程中不可避免地對土著微生物造成影響，而致使后續的生物過程失效。因此評價化學氧化后土壤中的微生物的群落結構和功能基因的變化對后期的生物降解過程具有重要的意義。

目前在對Fenton試劑的研究中提出采用固體Na2CO3·1.5H2O2(溶于水后分解：Na2CO3?1.5H2O2→Na2CO3+1.5H2O2)來替代H2O2形成Fenton試劑，通過Na2CO3·1.5H2O2緩慢釋放H2O2來避免與石油烴反應時發生的自由基淬滅反應[15]。因此，本研究采用H2O2和Na2CO3·1.5H2O2所形成的兩種類Fenton試劑對石油烴污染的土壤進行氧化處理，然后通過16s rDNA高通量技術對土壤中土著微生物的群落結構和功能基因進行分析。

1 實驗部分

1.1 試劑材料和儀器

過氧化氫(ω(H2O2)=30%，分析純)、過碳酸鈉(Na2CO3·1.5H2O2，分析純)、四氯化碳(CCl4，分析純)、七水合硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O，分析純)、一水合檸檬酸(C6H8O7·H2O，分析純)，FastDNA kit for soil(MP Biomedicals)，Tris-HCl緩沖液。

實驗土壤采自新疆油田原油污染地區，挑除石塊、動植物殘體后過2 mm篩，密封后于-70℃冰箱保存。石油污染土壤的基本理化性質見表1。

表1 石油污染土壤的基本理化性質

實驗所用儀器包括：KH-600TDB型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)、LD5-10B型低速大容量離心機(江蘇同居科技儀器有限公司)、Oil-480型紅外測油儀(北京華夏科創儀器股份有限公司)、7900型PCR儀(美國ABI)、QuantiFluorTM-ST 微型熒光計(美國Promega-GloMax Prome)。

1.2 分析方法

土壤含油率的測定采用超聲萃取法[16]，即稱取干重為5 g的土壤于EPA VOA瓶中，然后在瓶中加入10 mL CCl4溶液后于100 W的超聲波條件下超聲10 min；隨后在800 r/min的離心機中進行離心5 min；將上清液通過盛有1 cm厚度的無水硫酸鈉(300℃干燥2 h)長頸玻璃漏斗(漏斗頸部塞有少許玻璃棉)收集至錐形瓶中；然后重復上述步驟至樣品液無色。最后上清液通過稀釋于紅外測油儀中進行測定。

1.3 土壤微生物的測序

采用FastDNA kit for soil試劑盒對土壤中的DNA進行提取，完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA，再使用帶有barcode的特異引物進行PCR擴增；參照電泳初步定量結果，將PCR產物用QuantiFluorTM-ST進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。

1.3.1 Miseq文庫構建

Miseq文庫構建主要包括以下步驟：

1)通過PCR將Illumina官方接頭序列添加至目標區域外端；

2)使用凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產物；

3)Tris-HCl緩沖液洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測；

4)氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA片段。

1.3.2 Miseq測序

Miseq測序主要包括以下步驟：

1)DNA片段的一端與引物堿基互補，固定在芯片上；

2)以DNA片段為模板，芯片上固定的堿基序列為引物進行PCR合成，在芯片上合成目標待測DNA片段；

3)變性、退火后，芯片上DNA片段的另一端隨機與附近的另外一個引物互補，也被固定住，形成“橋(bridge)”；

4)PCR擴增，產生DNA簇；

5)DNA擴增子線性化成為單鏈；

6)加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的dNTP，每次循環只合成一個堿基；

7)用激光掃描反應板表面，讀取每條模板序列第一輪反應所聚合上去的核苷酸種類；

8)將“熒光基團”和“終止基團”化學切割，恢復3′端黏性，繼續聚合第二個核苷酸；

9)統計每輪收集到的熒光信號結果，獲知模板DNA片段的序列。

1.4 實驗設計

實驗共分3組，分別為空白組(CK)、H2O2形成的類Fenton試劑組(HP)和Na2CO3·1.5H2O2形成的類Fenton組(SPC)，每組稱取所采集土壤樣品100 g于250 mL錐形瓶中，實驗前分別配置0.5 M的FeSO4·7 H2O和0.5 M的C6H8O7·H2O溶液，過程中依次加入檸檬酸溶液和硫酸亞鐵溶液，然后加入H2O2溶液和Na2CO3·1.5 H2O2固體，最后補充去離子水使水土比控制為1∶1。藥劑添加后，將錐形瓶置于恒溫搖床中于30℃、150 r/min下反應2 d，實驗配方如表2。

表2 實驗配方

2 結果與討論

2.1 兩種氧化方式對原油的降解效果比較

氧化后土壤中的原油含量如圖1所示，由圖1可見，SPC組對原油的降解效果明顯好于HP組，其中SPC組經過氧化后原油含量從42 326.24 mg/kg降解到20 960.33 mg/kg，相應的降解率達到50.48%，而HP組氧化后的原油含量為27 689.33 mg/kg，降解率為34.58%。占升等[15]應用H2O2和Na2CO3·1.5H2O2活化Na2S2O8對PAHs污染的土壤進行降解，得出Na2CO3·1.5H2O2活化好于H2O2，這可能是由于Na2CO3·1.5H2O2為有載體的H2O2，在反應的過程中緩慢釋放H2O2，進而避免了氧化劑產生的自由基間的淬滅反應，導致其降解效果更好。

圖1 氧化后各組的原油含量

2.2 兩種氧化方式對土著微生物多樣性的影響

氧化反應后，對3個樣品土壤中的Alpha微生物多樣性分析，計算的Shannon、Simpson、Ace、Chao、Coverage等指數如表3所示。

表3 土壤樣品微生物群落多樣性指數

Chao和Ace指數表征樣品微生物群落豐度，數值越大豐度越高，從表3得出，兩種氧化劑均使微生物群落豐度降低，未進行氧化的CK組，其Chao指數和Ace指數分別為287.833 333和283.126 841，而經過HP和SPC氧化處理后的Chao和Ace則降低到210～220，且這兩種氧化方式對微生物群落豐度的影響相差不大。Shannon指數和Simpson指數表征微生物的多樣性及均勻性。由表3可知，經過氧化處理后Shannon指數變化不大，即說明氧化后對微生物的多樣性影響不大。比較兩種氧化劑氧化后的Simpson指數發現，HP氧化后其Simpson指數降低，這表明經過HP氧化后土壤中的微生物群落均勻性變差，而SPC氧化后的Simpson指數則變化不大。

通過對圖2的3個土壤樣品OUT分布物種Venn圖可以得出CK組、HP組和SPC組共有的OUT有146個，經過氧化處理的HP和SPC組均與未進行氧化處理的空白組共有的OUT有166(146+20)，且經過HP和SPC氧化后的物種大部分是相同的。

圖2 土壤樣品OUT分布Venn圖

在門水平分析土壤樣品中的微生物群落結果組成，如圖3所示，化學氧化后，土壤中的優勢菌種發生變化，未進行氧化的CK組，其優勢菌種為放線菌門(Actinobacteria)占整體的47.16%，其次為變形菌門(Proteobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)分別占總體的31.54%和18.58%。而經過HP和SPC氧化后土壤中的優勢物種均變為了變形菌門(Proteobacteria)，放線菌門(Actinobacteria)則變為次級優勢種群，但所占的比例各有不同，在HP組中占80.66%，而在SPC組則占據61.16%。其次CK組中存在的異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)(1.46%)則在氧化后消失。有研究表明[17]放線菌門(Actinobacteria)可以在高溫，低含水量的條件下形成孢子，被認為是對有機質分解均有良好作用的菌門。在本研究中放線菌門在長期原油污染土壤中形成了優勢菌屬，具有一定的原油降解能力，但經過化學氧化后此菌門變為次一級的優勢物種，因此若后續進行生物修復，可能化學氧化具有一定的影響。

圖3 不同氧化處理后樣品中微生物群落結構組成(門水平)

2.3 氧化后功能基因變化情況

氧化后功能基因變化采用KEGG基因組數據庫進行分析，具體包括細胞過程通路、新陳代謝通路、遺傳信息處理通路、環境信息處理通路、人類病癥相關通路和生物體系統通路[18]。不同氧化方式氧化前后在KEGG Pathway 功能分類上所含基因數目和豐度情況如圖4所示。從圖4可看出兩種氧化劑氧化后在基因數量上均出現降低的現象，未進行氧化的CK組總基因數量為58 093 193個，而經過HP和SPC氧化后總基因數量則分別下降到36 282 211個和32 355 524個，其中對控制新陳代謝通路上的基因影響最大，由CK的34 975 895個分別降低到20 775 146和19 424 732個，SPC對基因數量的影響更大。這是由于氧化劑也是殺菌劑，氧化過程中致使一部分的土著微生物死亡所致[14]。然而在各種基因在總體基因的豐度上變化不大，其中HP氧化后在細胞過程通路和環境信息處理通路占比略有增加，分別從原占比的3.74和16.3增加到5.68和17.76。

圖4 氧化前后在KEGG Pathway 功能分類上所含基因數目和豐度情況

3 結 論

1)H2O2和Na2CO3·1.5H2O2形成的類Fenton試劑對原油污染土壤的石油類降解率分別為34.58%和50.48%，Na2CO3·1.5H2O2所形成的類芬頓試劑降解效果更好。

2)H2O2和Na2CO3·1.5H2O2形成的類Fenton試劑氧化后均對土壤中的土著微生物豐度產生影響，表征微生物群落豐度的Chao和Ace指數有原來的287.833 333和283.126 841降低到210～220，且氧化后土壤中的優勢微生物種群發生變化，原來的放線菌門(Actinobacteria)變為次級優勢種群，而變形菌門(Proteobacteria)成為新的優勢種群。

3)氧化后土壤中的總基因數量降低，兩種氧化方式氧化后總基因數量由58 093 193個分別下降到36 282 211個和32 355 524個，而各種通路基因在總基因的占比變化不大，其中HP氧化后在細胞過程通路和環境信息處理通路占比略有增加，分別從原占比的3.74和16.3增加到5.68和17.76。