雪茄煙品種Beinhart1000-1赤星病抗性基因的QTL定位

童治軍 張誼寒 陳學軍 曾建敏 方敦煌 肖炳光

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雪茄煙品種Beinhart1000-1赤星病抗性基因的QTL定位

童治軍 張誼寒 陳學軍 曾建敏 方敦煌*肖炳光*

云南省煙草農業科學研究院 / 煙草行業煙草生物技術育種重點實驗室 / 國家煙草基因工程研究中心, 云南昆明 650021

由鏈格孢菌()引起的赤星病是最具破壞性的煙草葉斑病害之一, 在中國嚴重地影響煙草(L)的產量和質量。選育抗煙草赤星病的優良品種雖是預防該病最經濟、有效的途徑, 但因其抗性受數量性狀基因控制而很難通過常規育種手段實現。為了便于開展煙草抗赤星病分子標記輔助選擇育種, 本研究利用抗赤星病雪茄煙品種Beinhart1000-1和感病烤煙品種紅花大金元經雜交、自交產生的362個F2單株構建了一張包含670個SSR標記的煙草遺傳連鎖圖譜, 并結合組培快繁形成的F2株系的田間赤星病病情指數(DI), 在全基因組范圍內檢測獲得2個與煙草赤星病抗性相關的QTL, 分別位于第20和23連鎖群上的SSR標記TMs05179和TMs04022, 以及TM61049和TM62212之間。這2個QTL等位基因均來自抗病親本Beinhart1000-1, 它們一起解釋了兩親本間81%的病情指數(DI)差異及64%的加性效應。為下一步開展煙草抗赤星病的分子標記輔助育種奠定了基礎。

煙草赤星病; 簡單重復序列; 遺傳連鎖圖譜; 數量性狀基因座

赤星病由鏈格孢菌((Fries) Keissl)[1-3]引起, 是最具破壞性的煙草(L)葉斑病害之一, 在煙草的整個生育期內均有發生, 尤其在煙葉的成熟期更嚴重[1-4]。病害通常從煙株下部葉開始發生, 隨著葉片的成熟, 病斑自上而下發生[5]。最初在葉片上出現黃褐色圓形小斑點, 而后變成褐色, 并會逐步擴大, 病斑呈圓形或不規則圓形, 有同心輪, 外圍有淡黃色暈圈[6-8]。嚴重時, 病斑相互連接合并, 致使病斑焦枯、破碎。在中國, 赤星病在各個煙區廣泛發生, 嚴重影響煙草的產量和質量。

培育抗煙草赤星病的優良品種雖然是預防該病最經濟有效的途徑, 但其抗性屬于受微效多基因控制且極易受環境影響的數量性狀[9-12], 極大地增加了育種的難度。分子標記輔助選擇育種(MAS)是利用與目的性狀基因連鎖的分子標記快捷、有效地選擇目標性狀基因型, 加快作物育種進程[13]。對數量性狀(或微效多基因控制的復雜性狀)進行MAS的先決條件是利用分子標記對目的性狀掃描定位全基因組的QTL。迄今, QTL定位研究在煙草上雖有較多的報道[14-16], 但在煙草赤星病抗性基因QTL定位分析方面的報道較少[17-20]。究其原因是煙草栽培品種間的多態性水平極其低下[21-29], 高質量的煙草遺傳連鎖圖譜構建工作十分困難[30-33], 因而已報道的基于不完整(低質量)的煙草遺傳圖譜進行的赤星病抗性基因QTL定位分析的結果, 不能滿足煙草抗赤星病的分子標記輔助育種需求。

本研究旨在利用抗、感煙草赤星病品種Beinhart1000-1和紅花大金元經雜交、自交產生的F2作圖群體構建一張高質量煙草遺傳連鎖圖譜, 并結合組培快繁形成的F2株系的田間赤星病病情指數進行全基因組QTL定位分析, 檢測獲得與煙草赤星病抗性相關的QTL, 為下一步開展煙草抗赤星病的分子標記輔助育種工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

用于遺傳圖譜構建的群體是由紅花大金元和Beinhart1000-1經雜交、自交產生的362個F2單株構成。其中, 紅花大金元是具有優良品質但極易感煙草赤星病的烤煙品種, 而Beinhart1000-1則是由美國引進的具有煙草赤星病抗性的優良雪茄煙品種。2015年種植親本紅花大金元和Beinhart1000-1, 雜交后獲得其后代F1; 2016年種植F1和親本, 自交并收獲F2種子; 2017年種植包含親本、F1、F2各世代材料及抗、感對照品種。其中, 抗感對照品種(凈葉黃和Speight G-140)、兩親本和F1各種植3個重復, 每個重復15株, 共計45株; 此外, 用于田間煙草赤星病抗性鑒定的362個F2株系(組培快繁獲得), 每個株系含有45個具有相同基因型的組培單株, 即每個株系種植3個重復, 每個重復15個單株。于云南省玉溪市研和實驗基地種植以上試驗材料, 株行距為0.50 m×1.00 m, 按當地優質煙生產技術措施進行栽培管理。

1.2 組培快繁

通過外植體的處理、培養基的配置、組培室培養和再生植株誘導及移栽將362個F2單株進一步擴繁為362個F2株系。

1.3 接菌與抗性調查

將赤星病強致病力菌株0-268 (由云南省煙草農業科學研究院提供)接種于PDA培養基上, 在28℃條件下培養15 d, 待菌絲布滿培養基表面時, 保存在4℃的冰箱中備用[6]。在田間葉片接近成熟期時, 用1%滅菌葡萄糖溶液洗下菌苔, 過濾獲得分生孢子液, 再用1%葡萄糖、1%甘油、0.25%吐溫-80組成的水溶液配制10,000個mL–1的分生孢子懸浮液。利用新配置的煙草赤星病菌分生孢子懸浮液對兩親本、362個F2株系和抗、感病對照品種(凈葉黃和Speight G-140)進行接病菌試驗[34], 并在對照品種病情指數(DI)達到75%時, 按國家標準GB/T 23222-2008煙草病蟲害分級及調查方法進行調查。將3個重復共計45株接種煙株的所有葉片進行分級調查, 并計算出平均病情指數來替代原始F2單株的病情指數。

1.4 SSR標記分析

按照Tong等[32]方法提取和純化親本和362份F2單株的基因組DNA。參照Bindler等[30-31]和Tong等[33]進行SSR-PCR擴增體系配置和程序設置。參照Xu等[35]的方法進行PCR擴增產物的6%非變性聚丙烯酰胺凝膠(non- denaturing PAGE)電泳檢測。

1.5 遺傳圖譜構建

首先, 利用兩親本和F1三份材料對參試的SSR標記進行多態標記篩選, 選取呈共顯性多態的SSR標記進行F2群體基因型分析。其次, 將獲得的F2群體基因型數據經過偏分離分析(卡方檢測), 并將分離比符合1∶2∶1的標記用于遺傳連鎖圖譜的構建。最后, 利用作圖軟件JoinMapv 4.0[36]分析符合1∶2∶1分離比例的標記間的遺傳連鎖關系, 并利用軟件MapChart v2.22[37]繪制遺傳圖譜。參照Tong等[32-33]設置以上軟件相關參數。

1.6 QTL定位分析

基于構建獲得的遺傳圖譜并結合田間赤星病病情指數(DI), 利用MapQTL v 6軟件[38]提供的Restricted Multiple-QTL model Mapping (rMQM)方法進行全基因組QTL掃描定位, 相關參數設置為: Algorithm=Regression, Test statistic=LOD, Fit dominance for F2=Yes, Mapping step size=1.0, Maximum number of neighboring markers=30, Maximum number of iterations=10,000, Number of permutations=10,000。按照McCouch等[39]的方法命名QTL, 即前綴q+性狀名稱縮寫+ LG數目。

2 結果與分析

2.1 赤星病抗性鑒定

由田間鑒定結果可知, 兩親本間的赤星病抗性差異較大, Beinhart1000-1和紅花大金元的平均病情指數(DI)分別為7.39 (變異范圍為2.03~13.96)和91.28 (變異范圍為78.85~98.38)。

赤星病的病情指數在由組培快繁獲得的F2群體中呈連續性分布(變異范圍為2.30~98.13), 即呈典型的正態分布且所有的數據均落在兩親本內(圖1)。這一結果與已報道的研究結果相符, 即煙草赤星病的抗性是典型的數量性狀[9-12,20,40]。同時也表明, 在F2群體中不存在赤星病抗性的超親分離現象, 這意味著感病(高值病情指數)和抗病(低值病情指數)的等位基因在兩親本間是完全連鎖在一起的, 即所有高值病情指數的親本具有易感病的等位基因, 而所有低值病情指數的親本具有抗病等位基因。

圖1 煙草赤星病病情指數在F2群體中的分布頻率

2.2 遺傳連鎖圖譜構建

利用雙親(紅花大金元和Beinhart1000-1)及其F1三份材料, 對共計38,437對SSR引物(TM、TMt、TMs和PT系列引物分別為11,302、12,016、10,000和5119對)進行多態性分析, 其中, 僅篩選出677對(TM、TMt、TMs和PT系列多態性引物分別為138、187、172和180對)在兩親本間有多態且在F1上呈共顯性的SSR引物, 多態率低至1.76% (677/38,437)。利用篩選出的穩定且呈共顯性多態的SSR引物在362個F2單株中所獲得的基因型數據進行連鎖分析, 最終獲得一張含有670個SSR標記、較均勻分布于24個連鎖群、覆蓋煙草基因組總長度為2878.732 cM、相鄰標記間的平均距離為4.297 cM的高質量煙草遺傳連鎖圖譜。每條連鎖群所包含的SSR 標記數目在13(LG05)~43(LG02)之間, 各染色體的長度范圍是43.122 cM (LG19)~186.598 cM (LG22), 各染色體相鄰標記間平均間隔的變化在2.398~6.794 cM之間。此外, 受益于共有的180個PT系列標記, 我們參照Bindler等[30-31]公布的圖譜將本研究構建獲得的連鎖群編號, 使二者的連鎖群順序和編號保持一致。

2.3 QTL定位分析

最終有2個與煙草赤星病抗性基因相關的QTL被檢測到, 分別位于第20(LG20)和第23(LG23)連鎖群上 (表1)。其中,是2個QTL中具有最大效應值的一個, 可解釋18.31%的表型變異。2個QTL均具有顯著的加性效應, 但僅有表現出顯著的顯性效應, 這表明, 感病基因(具有較高的DI值)相對于抗病基因(具有較低的DI值)呈現出完全顯性。此外, 2個抗病的等位基因全部源自抗病親本Beinhart1000-1。

圖2 基于362個F2單株(紅花大金元×Beinhart1000-1)的煙草赤星病抗性QTL定位結果

圖中每條連鎖群的左右兩側分別為遺傳距離(厘摩爾)和標記名稱, 其中, 紅色標記表示位于Bindler等[30-31]公布的連鎖群上。

In each linkage group, the positions (cM) and names of markers were shown on the left and right side, respectively. The red markers were mapped in the genetic map constructed by Bindler et al.[30-31]

表1 煙草赤星病抗性QTL定位結果

a負的加性效應值表示源自抗病親本Beinhart1000-1的等位基因(位點)降低了煙草赤星病的病情指數。b表示QTL解釋的表型變異比率。

aNegative additive effect indicates that the allele from resistant parent Beinhart1000-1 decreases the value of the trait (disease index).bPercentage of phenotypic variation explained by the QTL.

3 討論

由于用于構建作圖群體的雙親間親緣關系較近, 因此, 本研究中用于構建遺傳連鎖圖譜的標記較少, 且標記的多態性水平較低(1.76%; 677/38,437), 遠低于Bindler等[31]所用標記的多態率(46.16%; 2363/5119)。本研究利用670個多態SSR標記構建的圖譜中雖然也包含24個連鎖群(與普通栽培煙草中所擁有的24對染色體一致), 但仍然存在標記數目較少的連鎖群, 尤其是LG05連鎖群其上僅有13個標記。相較于Bindler等[31]公布的含有2363個SSR標記分布在24個連鎖群上且覆蓋全基因組3270 cM的高密度煙草遺傳連鎖圖譜, 我們構建的圖譜有待進一步完善。其差距在于: 1) 作圖的親本材料不同。本研究所用的材料均屬于栽培煙草且紅花大金元與Beinhart1000-1間具有很近的(或相似的)親緣關系; 而Bindler等[30-31]使用的2個親本材料間的親緣關系較遠(雙親間的遺傳相似性系數GS≈0.385), 接近于栽培煙草與野生煙草間的親緣關系。2) 基因型分析所使用的試驗檢測系統不同。本研究使用的實驗檢測系統(6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠和銀染顯色)的分辨率及靈敏度均較低; 而Bindler等[30-31]的檢測系統(Applied Biosystems 3100 Genetic Analyzers)很靈敏, 因此, 那些具有較小片段長度差異的標記很可能在我們的試驗系統中無法檢測出來。

本研究所使用的2個親本材料的赤星病抗性表現剛好呈現出2個極端且沒有超親遺傳現象在F2群體中表現出來(即, F2群體中的赤星病病情指數變異范圍完全包含在抗、感兩親本的赤星病DI值內)。這表明, 所有的抗、感病等位基因分別來自抗、感病親本。此外, 在不計上位性效應的前提下, 兩親本間不同的DI值(91.28-7.39= 83.89)應該是由加性效應的累積產生的。QTL定位的結果也與赤星病田間表型數據在兩親本和F2群體中的分布相符合, 即所檢測到的2個低DI值QTL的等位基因均來自抗病親本Beinhart1000-1。根據加性效應值且不計上位性效應的前提下, 檢測到的2個QTL共同解釋了兩親本間53.58 [2′(15.87+10.92)]或約64% (53.58/83.89)的加性效應值。這就意味著, 通過利用在抗病親本Beinhart1000-1中的2個QTL對應的等位基因與感病親本紅花大金元替換后, 紅花大金元的DI值如預期一樣地由89.25降低至39.73。因此, 本研究篩選獲得的2個QTL可應用于煙草抗赤星病的分子標記輔助育種。

前人關于煙草赤星病抗病基因QTL定位分析的研究主要集中在抗病烤煙品種凈葉黃上[17-19], 通過對比發現(二者用于QTL定位的標記和連鎖群順序是相同的, 均按照Bindler等[31]公布的連鎖群排序), Tong等[17]獲得的3個源自凈葉黃的赤星病抗性QTL與本研究獲得的2個QTL不同, 前者分別位于第3 (LG03)、第4 (LG04)和第17 (LG17) 3個連鎖群上, 而后者分別位于第20 (LG20)和第23 (LG23) 2個連鎖群上。因此, 源自凈葉黃與源自Beinhart1000-1的赤星病抗性基因(QTL)是不同的。目前僅有1篇基于Beinhart1000-1的赤星病抗性QTL定位分析研究[20], 雖也檢測獲得2個QTL(分別位于第7和第15連鎖群上的RBS-1和RBS-2), 但二者因使用的標記和連鎖圖譜不同而無法進一步將同是源自Beinhart1000-1赤星病抗性的4個QTL間的關系進行比較。

本研究通過對2個QTL兩側的標記進行檢測, 在362個F2單株中分別有5株和3株與紅花大金元和Beinhart1000-1一致的基因型單株, 其平均DI值分別為85.93 (變異范圍為78.38~91.57)和17.96 (變異范圍為9.49~26.17)。所以, 這兩組的DI值差異為85.93–17.96= 67.97 (占兩親本間DI值差異的81%), 解釋了23%的加性效應值(2個QTL共同解釋了64%)。這說明, 在2個QTL的加性效應中存在著兩兩間的互作效應(上位性效應), 這也正解釋了兩親本間剩余19% (100%~81%)的DI值。與預期一致, 上位性效應與加性效應均在同一方向上提高兩親本間DI值的差異。因此, 在2個QTLs中與Beinhart1000-1基因型相同的單株可能是赤星病抗性最優的。

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Mapping of quantitative trait loci conferring resistance to brown spot in cigar tobacco cultivar Beinhart1000-1

TONG Zhi-Jun, ZHANG Yi-Han, CHEN Xue-Jun, ZENG Jian-Min, FANG Dun-Huang*, and XIAO Bing-Guang*

Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences / Key Laboratory of Tobacco Biotechnological Breeding / National Tobacco Genetic Engineering Research Center, Kunming 650021, Yunnan, China

Tobacco brown spot (TBS) caused byis one of the most destructive foliar diseases affecting tobacco (L) production and quality in China. Breeding TBS-resistant cultivars is difficult by traditional method because the resistance has proved to be quantitatively inherited. To facilitate marker-assisted selection, we carried out a study of mapping quantitative trait loci (QTLs) for TBS resistance. We developed an F2population consisting of 362 individuals from a cross between a TBS-susceptive flue-cured tobacco Honghua Dajinyuan (HD) and a TBS-resistant cigar tobacco cultivar Beinhart1000-1, and constructed a genetic map consisting of 670 SSR markers based on this population. Using disease index (DI) as the indicator of TBS resistance, we detected two QTLs located between SSR markers TMs05179 and TMs04022, and TM61049 and TM62212 on linkage group (LG) 20 and LG23, respectively. The resistant alleles of the two QTLs were all from the resistant parent Beinhart1000-1. The two QTLs together could explain 81% of the DI difference between the two parents in total, and 64% of their additive effects. Therefore, the two QTLs will be useful for TBS resistance breeding.

tobacco brown spot (TBS); simple sequence repeats (SSR); genetic linkage map; quantitative trait locus (QTL)

2018-03-05;

2018-12-24;

2019-01-05.

10.3724/SP.J.1006.2019.84035

方敦煌, E-mail: fdhkm@sina.com; 肖炳光, E-mail: xiaobg@263.net

E-mail: tzj861@163.com

本研究由云南省基礎研究計劃項目(2018FB064), 中國煙草總公司項目(110201601027(JY-01), 110201603008)和中國煙草總公司云南省公司項目(2017YN01, 2016YN23)資助。

This study was supported by the Fundamental Research Program of Yunnan Province (2018FB064), China National Tobacco Company (110201601027 (JY-01), 110201603008), and Yunnan Tobacco Company (2017YN01, 2016YN23).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190103.0910.004.html