棉花中GhTFL1a和GhTFL1c基因的表達及啟動子分析

張曉紅 胡根海 王寒濤 王聰聰 魏恒玲 付遠志 喻樹迅,*

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棉花中和基因的表達及啟動子分析

張曉紅1胡根海1王寒濤2王聰聰2魏恒玲2付遠志1喻樹迅2,*

1河南科技學院生命科技學院 / 現代生物育種協同創新中心, 河南新鄉 453003;2中國農業科學院棉花研究所 / 棉花生物學國家重點實驗室, 河南安陽 455000

從陸地棉中克隆了磷脂酰乙醇胺結合蛋白和基因, 并對該基因進行表達分析、啟動子預測和啟動子活性研究。利用啟動子分析軟件PlantCARE預測得出,啟動子區域有脫落酸響應元件、干旱誘導的MYB結合位點和頂芽特異表達響應元件等;啟動子區域有乙烯響應元件、干旱誘導的MYB結合位點和水楊酸響應元件。因此, 將和分別構建到啟動子檢測載體pBI121-GUS上形成融合表達載體, 通過煙草瞬時轉化檢測得出這2個基因的啟動子都具有活性。實時熒光定量PCR分析表明,和在光周期處理和不同材料的陸地棉(栽培種和半野生種)中表達模式呈相反趨勢?；蚴苊撀渌?abscisic acid, ABA)、水楊酸(salicylic acid, SA)和鹽脅迫誘導, 而可以響應赤霉素(gibberellin, GA)、SA和ABA脅迫研究結果初步表明,和可能參與了植物逆境脅迫脫落酸和水楊酸響應的調控, 為在棉花中進一步闡明其功能奠定了基礎。

陸地棉;;; 表達分析; 啟動子活性

棉花是我國最重要的經濟作物之一, 在我國國民經濟中占有舉足輕重的地位。目前在棉花種植結構調整, 推進植棉全程機械化進程的大形勢下, 早熟作為棉花育種的重要目標性狀顯得尤為重要[1]。開花是棉花由營養生長向生殖生長過渡的標志, 也是培育早熟棉的一個重要指標, 同時也是決定棉花能否獲得豐產的重要農藝性狀[2]。通過對花發育相關基因的功能分析, 進行棉花品種熟性分子改良, 對實現棉花機械化直播和采收具有重要意義。

磷脂酰乙醇胺結合蛋白(phosphatidylethanolamine binding protein, PEBP)在原核生物和真核生物中均被發現[3-5],其氨基酸結構均有保守的磷脂酰乙醇胺結合蛋白結構域, 但是在原核生物和真核生物中仍然存在很大差異。TFL1 (TERMINAL FLOWER1)是磷脂酰乙醇胺結合蛋白中的一個亞組, 該亞組基因的功能大部分都集中在開花調控通路。在擬南芥中,()是TFL1亞組中的一個基因, 其功能主要表現在鹽脅迫信號途徑[6]。和()也是該亞組中的2個基因, 這2個基因在營養生長階段頂芽中積累較少, 但是在開花之后其表達量急劇升高。擬南芥中通過維持莖頂端分生組織和花序分生組織的無限性, 延長植株的營養生長過程, 從而延遲植株的生殖生長進程[7]。Conti等[8]研究表明TFL1蛋白通過運輸到達頂芽, 并且調控擬南芥的植株結構。同時, TFL1蛋白能抑制和基因的表達并且保持花序的無限生長[9]。對基因進行啟動子結構的研究發現, 該基因是在營養器官的分生組織中表達來控制開花時間[10]。Liu等[11]在山茱萸中發現過表達轉化擬南芥后, 擬南芥開花時間推遲, 植株高度增加, 頂端花芽和次生花序分枝增多。Rantanen等[12]發現在溫度和光周期的互作下, 林地草莓中基因能適時調控開花時間。Si等[13]研究發現陸地棉基因與果枝形成發育相關, 但是棉花中該基因的啟動子分析還無報道。

本研究依據棉花基因組測序結果[14-15], 克隆到和基因及其啟動子, 同時進行光周期、激素和脅迫處理分析其表達模式, 并分析其啟動子活性, 旨在摸清和表達調控的分子機制, 從而為棉花分子改良提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用陸地棉栽培種“中棉所36”和半野生種“尖斑棉”。試驗所用到的DNA聚合酶、反轉錄酶、pMD18-T載體、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒和熒光定量試劑盒均購自Takara公司, RNA提取試劑盒購自天根公司, 大腸桿菌感受態DH5a、pBI121載體及農桿菌LBA4404由本實驗室制備并保存。

1.2 材料處理及取樣

用于光周期處理試驗的材料種植于中國農業科學院棉花研究所早熟組人工氣候培養室, 栽培種為“中棉所36”和半野生種為“尖斑棉”, 培養條件為長日照, 等到二葉展平時期, 短日照處理一周, 并將處理過后的棉花分兩批繼續培養, 一批為長日照(14 h/10 h 光照/黑暗, 光照時間為8:00–22:00), 另一批為短日照(10 h/14 h 光照/黑暗, 光照時間為8:00–18:00), 溫度都為28℃, 取樣時期分別于子葉展平期到五葉展平期, 取樣后快速放入液氮中冷凍并存于-80℃冰箱中備用。激素處理所用材料為“中棉所36”水培材料, 室內種植條件為14 h光照/10 h黑暗, 溫度為26℃。于三葉期水培液中增加激素和脅迫處理, 以清水為對照。所用SA濃度為200 μmol L–1, ABA和GA濃度為100 μmol L–1, 處理后的1、3、7、12和24 h時間段進行根部取樣, 選取10株左右水培苗剪下幼嫩根部, 吸取根部水分后液氮冷凍并置-80℃冰箱備用, 試驗重復3次, 利用GraphPad Prism 5軟件作圖及統計分析。

1.3 GhTFL1a和GhTFL1c的生物信息學分析

研究中所用到的氨基酸序列下載自NCBI網站, 使用ClustalX2軟件多重序列比對, 使用MEGA6.06最大似然法構建進化樹。利用ExPASy網站上的Compute pI/Mw (http://web.expasy.org/compute_pi/)對其蛋白質的理化性質進行預測和分析, 并用NCBI的CDD (https://www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)數據庫對其結構域進行預測。用PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/)預測啟動子區域順式作用元件。

1.4 基因的定量表達分析

RNA用天根多糖多酚RNA提取試劑盒提取, RNA的質量必須保證OD260/280為1.8~2.1, OD260/230大于1.8。用Takara RR047A試劑盒反轉錄, 使用gDNA Eraser消化總RNA中殘留的基因組DNA后進行15 min的反轉錄反應合成cDNA。使用Takara RR420A試劑盒及SYBR Green分析熒光定量, 所用儀器為Applied Biosystems Q6實時熒光定量PCR儀。陸地棉中以為內參。所用引物見表1。

1.5 GhTFL1a和GhTFL1c啟動子克隆和瞬時表達

利用Perl語言編寫的腳本, 從陸地棉基因組中獲取和基因上游約2000 bp的序列, 根據啟動子順式作用元件預測結果設計引物(表1), 從翻譯起始位點(ATG)上游開始, 以中棉所36基因組為模板, 克隆啟動子片段。使用 Infusion 連接酶(寶生物, 大連)與載體pBI121連接啟動子片段, 雙酶切位點是d III和I, 將和構建到啟動子檢測載體pBI121-GUS上形成融合表達載體, 將連接后新鮮菌液送金唯智生物科技有限公司測序, 并保存測序正確的單克隆菌液以供后續試驗使用。本氏煙草()按照Sparkes等[16]的方法種植和瞬時表達。

表1 本研究所用引物

1.6 GUS染色

取瞬轉后的煙草葉片組織, 加入GUS染色液, 37℃培養箱中溫育過夜24 h。接著, 依次用體積分數為70%、80%、90%和無水乙醇脫色。最后, 在體式顯微鏡(SOPTOP, SZN)下觀察組織的染色情況并照相。

2 結果與分析

2.1 陸地棉GhTFL1a和GhTFL1c的序列分析

基因位于陸地棉A亞組第11染色體上, 編碼框長522 bp, 編碼氨基酸長度為173 aa。經ExPASy網站預測知, 其編碼蛋白質約為19.3 kDa, 等電點為9.68?；蛭挥贒亞組第4染色體上, 編碼框長519 bp, 編碼氨基酸長度為172 aa, 編碼蛋白質約為19.1 kDa, 等電點為8.09。進化樹分析結果表明,和分別與擬南芥中的和親緣關系相近(圖1-A), 根據TAIR網站提供的擬南芥氨基酸序列進行序列比對, 氨基酸序列具有比較保守的磷脂酰乙醇胺結合蛋白結構域(圖1-B)。

圖1 GhTFL1a和GhTFL1c的進化樹及氨基酸多重序列比對

A: 進化樹分析; B: 氨基酸多重序列比對。*代表氨基酸完全一致,、和序列號分別為NM_125597、U77674和NM_128315,和在陸地棉中序列號分別為Gh_A11G0088和Gh_D04G0971。

A: phylogentic analysis of/and their homologous genes in; B: alignment of amino acid sequences of/and their homologous genes in. * indicates the same amino acid, the ID of,, andis NM_125597, U77674, and NM_128315, respectively, the ID ofandis Gh_A11G0088 and Gh_D04G0971, respectively.

2.2 苗期葉片中GhTFL1a和GhTFL1c基因的表達模式分析

為研究和是否受光周期影響, 利用光周期試驗處理半野生種和栽培種材料, 對不同時期幼苗葉片取樣分析表明,和在半野生種及栽培種陸地棉中表達趨勢一致,表達在長日照下明顯高于短日照下(圖2-A和圖2-C), 而三葉期的表達量在短日照下高于長日照下, 隨后表達量逐漸降低并低于長日照下(圖2-B和2-D)。同時, 對這2個基因在栽培種棉和半野生棉中的表達模式進行分析發現,在半野生棉中表達量高于栽培棉(圖3-A), 而在栽培棉中表達量高于半野生棉(圖3-B)。說明從半野生種棉到栽培種棉的進化過程中, 光照條件從短日照促進開花基因的表達向光照不敏感轉化, 同時在光周期的影響下,和可能具有相反的生物學功能, 仍需對多個栽培種和半野生種材料進行后續驗證。

圖2 GhTFL1a和GhTFL1c在光周期處理試驗中的表達模式分析

A和B為和基因在栽培種“中棉所36” 中的表達; C和D為和基因在半野生種“尖斑棉”中的表達。誤差棒為3次重復的標準差。

A and B indicate the expression ofandin cotton cultivar “CCRI 36”; C and D indicate the expression ofandin semi-wild cotton. Error bars indicate the standard deviation (±SD).

圖3 GhTFL1a和GhTFL1c在栽培種和半野生種中表達模式分析

橫坐標代表取樣時期, 分別為長日照子葉、一葉、二葉、三葉、四葉、五葉以及短日照三葉、四葉和五葉。

The abscissa shows period, which from left to right is expanded cotyledon, first, second, third, forth, and fifth leaves in long day, and third, forth and fifth leaves in short day.

2.3 GhTFL1a和GhTFL1c的啟動子分析及其對外源激素的應答

該基因擁有磷脂酰乙醇胺結合蛋白的保守結構域, 因此分析啟動子的順式作用元件對于揭示和的功能是非常必要的。從中棉所陸地棉基因組數據庫中獲取和基因起始密碼子上游2000 bp的序列, 并利用PlantCARE數據庫對其順式作用元件進行了預測。結果如表2所示。這2個基因的啟動子上主要存在兩大類順式作用元件, 一類是光響應元件和生物鐘節律響應元件, 一類是脅迫響應元件, 如與脅迫相關的水楊酸、脫落酸和干旱脅迫等元件。已知GA是一種能促進種子發芽、植物生長和提早開花的生長調節劑, 而ABA、SA和鹽脅迫都是與植物逆境和脅迫響應相關的因素。

表2 陸地棉基因GhTFL1a和GhTFL1c啟動子順式作用元件預測

利用棉花水培方法來研究和在激素和脅迫處理下的應答模式。經SA處理3 h后的表達量開始升高, 12 h到達峰值, 表達量約是對照組的32倍(圖4-A)。經ABA處理3 h后處理組中的表達量開始升高, 7 h達到最大值, 隨后下降(圖4-B)。經GA處理后,的表達量與對照相比沒有顯著的倍數差異(圖4-C)。NaCl處理后,的表達量在3 h和12 h出現峰值(圖4-D)。以上結果表明, SA、ABA和鹽脅迫都可以顯著促進陸地棉中的表達, 而GA對的轉錄無明顯作用,可以響應SA、ABA和鹽脅迫。經SA處理后,的表達量一直在降低, 到12 h表達量降到最低點, 對照組中表達量約是該基因表達量的26倍(圖5-A)。經ABA處理3 h后處理組中的表達量開始下降, 7 h達到最小值, 隨后上升(圖5-B)。經GA處理后,的表達量開始上升, 3 h后表達開始下降(圖5-C)。NaCl處理后,的表達量與對照相比沒有明顯的倍數差異(圖5-D)。SA、ABA和GA處理后,的表達量都比對照低。以上結果表明, SA、ABA和GA都可以抑制陸地棉中的表達, 而鹽脅迫對的轉錄無明顯作用,可以響應SA、ABA和GA脅迫。

圖4 棉花水培苗經過處理后24 h內GhTFL1a基因表達量變化

A: 水楊酸; B: 脫落酸; C: 赤霉素; D: NaCl。誤差棒為3次重復的標準差。

A: salicylic acid; B: gibberellins; C: abscisic acid; D: NaCl. Error bars on the columns indicate the standard deviation (±SD).

2.5 GhTFL1a和GhTFL1c的啟動子活性分析

對和的啟動子進行克隆, 得到基因啟動子全長1558 bp,基因啟動子全長1631 bp。以煙草瞬時表達分析啟動子活性表明,和基因的啟動子都具有啟動活性, 與陽性對照pBI121相比, 活性較弱(圖6)。

圖5 棉花水培苗經過處理后24小時內GhTFL1c基因表達量變化

A: 水楊酸; B: 赤霉素; C: 脫落酸; D: NaCl。誤差棒為3次重復的標準差。

A: salicylic acid; B: gibberellins; C: abscisic acid; D: NaCl; Error bars indicate the standard deviation (±SD).

圖6 煙草瞬時表達GhTFL1a和GhTFL1c的啟動子

A: 陽性對照pBI121; B: pGhTFL1a∷GUS; C: pGhTFL1c∷GUS; D: 陰性對照。

A: positive control pBI121; B: pGhTFL1a∷GUS; C: pGhTFL1c∷GUS; D: negative control.

3 討論

開花是陸地棉的重要農藝性狀之一?；ㄆ诘脑缤碛绊懏a量, 也影響品種的區域適應性。雖然開花是一個由多基因控制的數量性狀, 經典遺傳學研究也表明許多開花相關的基因符合孟德爾遺傳定律[17]。陸地棉全基因組測序的完成對深入研究目標性狀的遺傳控制具有重要的意義和推動作用[14-15]。

近年來, 對棉花開花相關基因的克隆及功能研究較多[18-20], 而針對開花基因的啟動子的結構分析和蛋白表達調控等研究較少。本研究從陸地棉基因組數據庫中共檢 索到4條亞組基因, 并對其中的和進行表達調控、啟動子結構和活性分析。啟動子順式作用元件預測出和啟動子區域不僅包括基本的調控元件, 還包含許多與光、生物鐘、植物激素和逆境響應相關的調控元件。在植物的生長發育過程中, 光周期是一種重要的信號途徑來調控開花相關基因的表達[21-22]。本研究利用光周期對不同材料的陸地棉(栽培種和半野生種)處理發現和在半野生種及栽培種陸地棉中表達趨勢一致, 這也說明從半野生種棉到栽培種棉的進化過程中, 光照條件從短日照促進開花基因的表達向光照不敏感轉化。Zhang等[23]研究表明和在根中優勢表達, 我們根據啟動子區域的調控元件選擇了幾種激素和脅迫對棉花的水培苗進行處理, 并對這2個基因表達模式分析表明SA、ABA和鹽脅迫都可以促進陸地棉中的表達,與擬南芥中的親緣關系相近, 在高鹽脅迫下,基因通過介導FT-FD模型來提供合適的保護機制適應光周期途徑并促使開花[24]。由此推測可能參與鹽脅迫響應的調控通路。而陸地棉中與擬南芥中親緣關系相近, 該基因的表達在SA和GA處理下受到抑制。同時,和基因啟動子在煙草瞬時表達中具有活性。上述試驗處理都呈現出和在表達分析上是一種相反的表達模式, 這種結果是否可以推測2個基因具有相反的生物學功能, 還需要進一步通過轉基因對其進行驗證, 并通過對轉基因后代植株的脅迫處理來分析; 同時啟動子分析試驗表明這2個基因的啟動子都具有活性, 后期還需在擬南芥中進行表達部位的驗證來確定其是?；砸只蚴墙M成性啟動子, 這樣才能進一步深入掌握和基因及其啟動子的功能。

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Expression and promoter activity ofandin Upland cotton

ZHANG Xiao-Hong1, HU Gen-Hai1, WANG Han-Tao2, WANG Cong-Cong2, WEI Heng-Ling2, FU Yuan-Zhi1, and YU Shu-Xun2,*

1College of Life Science and Technology, Henan Institute of Science and Technology / Henan Collaborative Innovation Center of Modern Biological Breeding, Xinxiang 453003, Henan, China;2Institute of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences / State Key Laboratory of Cotton Biology, Anyang 455000, Henan, China

In this study, we cloned the phosphatidylethanolamine-binding proteinandgenes from Upland cotton, and analyzed their expression and promoter activity. The results of promoter structure prediction revealed thatpromoter contains abscisic acid (ABA) responsiveness elements, drought-induced MYB binding sites and shoot-specific expression and light responsiveness elements, and the promoter region ofcontains ethylene-responsive element, drought-induced MYB binding sites and salicylic acid (SA) responsiveness elements. Thus, we constructed the fusion vector pBI121-GhTFL1a-GUS and pBI121-GhTFL1c-GUS, respectively. Transient transformation of tobacco showed that both promoters had the activity to drive the expression of target gene. Quantitative Real-time PCR result indicated that the expression profile ofandwas opposite during different photoperiod treatments of cultivated and semi-wild cotton. Meanwhile, theexpression ofwas induced by ABA, SA, and salt (NaCl), whileexpression was induced by SA, gibberellin (GA) and ABA. Taken together, the results suggest thatandmight be involved in the regulation of response to abiotic stresses (SA and ABA), which could provide a solid foundation for further function identification.

upland cotton;;; expression analysis; promoter activity

2018-06-20;

2018-12-24;

2019-01-04.

10.3724/SP.J.1006.2019.84082

喻樹迅, E-mail: ysx195311@163.com

E-mail: 12-126meinv@163.com

本研究由河南省高等學校重點科研項目(18A210002)和棉花生物學國家重點實驗室開放課題基金(CB2018A08)的資助。

This study was supported by the Key Scientific Research Projects of Colleges and Universities in Henan (18A210002) and the State Key Laboratory of Cotton Biology Open Fund (CB2018A08).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20181230.2243.008.html