花生膜聯(lián)蛋白基因家族成員的結(jié)構(gòu)和表達(dá)分析

王慧敏 李新國 萬書波 張智猛 丁 紅 李國衛(wèi) 高文偉,*彭振英,,*

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花生膜聯(lián)蛋白基因家族成員的結(jié)構(gòu)和表達(dá)分析

王慧敏1李新國2萬書波3張智猛4丁 紅4李國衛(wèi)2高文偉1,*彭振英1,2,*

1新疆農(nóng)業(yè)大學(xué), 新疆烏魯木齊 830052;2山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心 /山東省作物遺傳改良與生態(tài)生理重點(diǎn)實(shí)驗室, 山東濟(jì)南 250100;3山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 山東濟(jì)南 250100;4山東省花生研究所, 山東青島 266100

植物膜聯(lián)蛋白(annexin)是一類鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白, 參與調(diào)控植物代謝和生長發(fā)育并協(xié)同調(diào)節(jié)抗旱、耐鹽等多種抗逆反應(yīng), 其結(jié)構(gòu)在不同植物中具有物種特異性。為系統(tǒng)分析花生膜蛋白基因家族, 對30個花生annexin (annexin of,)基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明 30個不均勻分布在13條染色體上, 其中A、B基因組中各有13個和17個。含有2~8個內(nèi)含子, 但大多數(shù)含有5~6個內(nèi)含子。聚類分析表明, 植物annexin聚類關(guān)系比較復(fù)雜, 低等植物、單子葉、雙子葉植物annexin間隔分布, AnnAhs穿插其中, 分布于各個分支中; 但在各個小分支中, AnnAhs 基本上都與雙子葉植物annexin聚在一起, 其中與大豆、苜蓿、向日葵親緣關(guān)系較近, 其次是擬南芥; 但個別AnnAhs與單子葉植物和低等植物annexin聚在一起。30個AnnAhs均無跨膜結(jié)構(gòu)域, 其中有16個AnnAhs定位于細(xì)胞質(zhì), 其余定位不明確。對可變剪切分析顯示, 僅有11個發(fā)生可變剪切事件, 占38%; 根中發(fā)生的最多, 其次是葉中, 種子中最少。根據(jù)表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),在seed2和根中表達(dá)量較高, 其次是seed1, 在葉中表達(dá)量較低。本文可為花生抗性育種提供一定的理論支撐。

花生; 膜聯(lián)蛋白; 基因結(jié)構(gòu)分析; 可變剪切分析; 表達(dá)模式分析

膜聯(lián)蛋白(annexin)是一類鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白, 廣泛存在于除酵母外的真核生物細(xì)胞中, 在進(jìn)化上屬于保守的多基因家族[1]。來源于脊椎動物、無脊椎動物、真菌和單細(xì)胞真核生物、植物和原生生物的 annexin被分為 A、B、C、D、E五大類[2], 動物annexin屬于A類和B類, 參與細(xì)胞中的胞飲、胞吐、細(xì)胞骨架、離子通道、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等多種重要的功能調(diào)節(jié)及多種信號調(diào)節(jié)[3-4]。植物annexin屬于D類, 約占植物總蛋白含量的0.1%[5], 與動物annexin在分子量、氨基酸序列及鈣離子與磷脂結(jié)合的能力上, 具有較高的同源性[2]。

目前, 動物annexin的研究主要集中在肺癌[6]、胃癌[7]、卵巢癌[8]、結(jié)直腸癌(CRC)[5]等相關(guān)疾病上, 如研究annexin在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平及其與臨床特征的相關(guān)性[6]。ANXA3與腫瘤細(xì)胞的化療藥物有關(guān), 對新藥開發(fā)與新療法探究有重要意義[9]; Annexin A2能夠激活纖溶系統(tǒng), 調(diào)控細(xì)胞骨架和重肌動蛋白, 在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中具有非常重要的作用[10]。

植物annexin研究起步晚于動物, 但是近幾年取得了初步進(jìn)展。研究表明, 植物annexin參與了細(xì)胞多個生命過程, 對許多物質(zhì)的合成途徑具有重要的調(diào)節(jié)作用。如小麥在小麥花藥中特異表達(dá), 但是在溫敏核不育系中不能被低溫誘導(dǎo)表達(dá), 表明特異性下調(diào)與小麥雄性不育具有相關(guān)性[11]; 棉花影響棉纖維的伸長, 并參與次生細(xì)胞壁的生物合成[12]。植物基因家族龐大, 其家族成員各自具有不同的功能分工和時空表達(dá)模式。植物的表達(dá)具有組織特異性, 在植物生長的各個階段、不同器官、組織中的表達(dá)模式各有不同, 并且參與植物代謝和生長發(fā)育的調(diào)節(jié)過程[13]。擬南芥中8個基因在各組織部位的表達(dá)水平各不相同, 其中只在幼苗下胚軸表達(dá), 而主要在幼苗胚軸和花絲中表達(dá)[14]。

Annexin亞細(xì)胞定位的多樣性也反應(yīng)出其功能的多樣性, 其定位與胞質(zhì)中的Ca2+濃度、細(xì)胞所處pH值以及外界環(huán)境有關(guān)[15-16]。Annexin通常為胞質(zhì)蛋白, 具有可溶型和結(jié)合型兩種形式。Annexin常常和液泡、細(xì)胞核、質(zhì)膜以及高爾基體等結(jié)合在一起[17-19]。Annexin也能夠可逆地與細(xì)胞骨架組成成分或介導(dǎo)細(xì)胞和胞外基質(zhì)間互作的蛋白結(jié)合。褚翠萍等[16]研究表明, 擬南芥中annexin2可能通過微絲骨架調(diào)節(jié)與介導(dǎo)的囊泡運(yùn)輸參與細(xì)胞分泌活動。植物annexin的表達(dá)受各種生物及非生物脅迫的影響, 且逆境脅迫會影響annexin的亞細(xì)胞定位。歐洲甜瓜受到機(jī)械損傷時, 薄壁細(xì)胞中的annexin 會從胞質(zhì)中重新定位于質(zhì)膜上[20]。

花生是世界范圍內(nèi)廣泛種植的油料和經(jīng)濟(jì)作物之一, 在國民經(jīng)濟(jì)占有重要地位。目前關(guān)于花生的研究多集中在產(chǎn)量和品質(zhì)上, 而關(guān)于抗逆性研究進(jìn)展緩慢。早期研究主要集中在抗逆性綜合評價及抗逆種質(zhì)篩選上, 而關(guān)于抗性機(jī)制研究相對較少。目前花生全基因組測序工作已經(jīng)完成[21], 為系統(tǒng)研究花生的功能基因奠定了基礎(chǔ)。本課題組王靖從花生“魯花14”中克隆了2個花生基因,和, 并用煙草進(jìn)行了耐鹽性檢驗, 發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下表達(dá)下調(diào)[22]。何美敬等[23]從花生中克隆獲得6個基因, 發(fā)現(xiàn)它們在鹽、旱、重金屬、低溫和激素處理下表達(dá)量均發(fā)生了改變。然而到目前為止, 有關(guān)花生基因在非生物脅迫中的作用機(jī)制還沒有得以系統(tǒng)研究。本文通過對進(jìn)行全基因組生物信息學(xué)分析, 并利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析其表達(dá)模式和可變剪接, 以期為深入研究其功能和調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 AnnAh全基因組檢索以及其他物種annexin獲得

運(yùn)用“annexin”關(guān)鍵詞在花生基因組數(shù)據(jù)庫(https://www.peanutbase.org/)中搜索, 獲得30個家族基因(表1), 命名為(of)。運(yùn)用“annexin”關(guān)鍵詞在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上搜索其他物種基因并下載其蛋白序列。搜索物種為擬南芥(, Ath)、大豆(, Gma)、苜蓿(, Mtr)、向日葵(, Han)、谷子(Sit)、水稻(, Osa)、玉米(, Zma)、卷柏(, Smo)、偽矮海鏈藻(, Tps)、三角褐指藻(Ptr)、綠色鞭毛藻(, Olu)、水蕨(, Cri)和小立碗蘚(, Ppa), 對以上物種名縮寫為大寫屬的首字母加小寫種的前2個字母。命名方法為其蛋白序列號加物種名縮寫(圖1)。

1.2 AnnAh生物信息學(xué)分析

利用Mega5.0軟件構(gòu)建annexin蛋白序列進(jìn)化樹, 構(gòu)建方法為鄰近法。用GSDS (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在線軟件分析基因結(jié)構(gòu)。利用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線軟件分析AnnAhs跨膜結(jié)構(gòu)域。在NCBI的Protein BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上進(jìn)行AnnAhs蛋白序列完整性分析。利用MEME (http://meme-suite.org/)和NCBI的Conserved domains (https://www.ncbi.nlm.nih. gov/Structure/cdd/wrp)在線軟件分析AnnAhs保守結(jié)構(gòu)域。利用Softberry (http://linux1.softberry.com/berry)在線軟件進(jìn)行AnnAhs亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.3 AnnAhs的表達(dá)模式和可變剪切分析

分別取花生品種“豐花1號”根、葉、果針入土30 d種子(seed1)、果針入土50 d種子(seed2)材料提取總RNA構(gòu)建cDNA文庫, 用鏈特異性測序方法測序。目前已將原始測序數(shù)據(jù)上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(編號為PRJNA354652)。用Cufflinks軟件(http://cufflinks. cbcb.umd.edu/)計算各基因或轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)豐度,用FPKM 來表示[24]。根據(jù)各的FPKM值, 用HemI軟件進(jìn)行表達(dá)模式分析。用ASprofile[25]軟件對的可變剪切分別進(jìn)行分類和數(shù)量統(tǒng)計。預(yù)測的可變剪切形式為TSS, 即轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)可變剪切; TTS為轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)可變剪切; SKIP為外顯子跳躍; IR為內(nèi)含子滯留; AE為可變外顯子5'或3'端可變剪切。

2 結(jié)果與分析

2.1 AnnAh在染色體上的分布

從花生基因組中共檢索到30個基因, 其中有12個序列不完整(表1)。它們不均勻地分布在13條染色體上, 其中A基因組中有13個, B基因組中17個。在Araip.B08、Aradu.A08、Araip.B10最多, 各有4個; 在Aradu.A10、Araip.B03各有3個; 在其他8條染色體上分布較少, 分別有1~2個。

2.2 植物annexin聚類分析

將AnnAhs與其他植物annexin構(gòu)建進(jìn)化樹(圖10)顯示, 植物annexin聚類關(guān)系比較復(fù)雜, 低等植物、單子葉、雙子葉植物annexin間隔分布, AnnAhs穿插其中, 分布于各個分支中, 顯示出annexin進(jìn)化關(guān)系的復(fù)雜性。在一些次級分支中, 單、雙子葉植物annexin聚在一起, 低等植物annexin聚為另一分支; 而在有些小分支中, 高等植物annexin直接和低等植物annexin聚在一起, 如玉米NP_001266716.1和綠色鞭毛藻XP_001420377.1聚在一起, 顯示出二者的高度相似性。

表1 Anneixn家族基因

(續(xù)表1)

基因名稱Gene name染色體位置Chr. position氨基酸個數(shù)Amino acid number亞細(xì)胞定位Subcellular localization蛋白完整性Protein integrityAnnexin結(jié)構(gòu)域Annexin domain重復(fù)序列Repetitive sequence其他結(jié)構(gòu)域Other domains Aradu.MBZ2MAradu.A10333－完整Complete220 Araip.1LR8IAraip.B0289C不完整Incomplete220 Araip.KR6F4Araip.B03323－完整Complete222 Araip.X0F2SAraip.B03317－完整Complete440 Araip.CCM9GAraip.B03286－不完整Incomplete430 Araip.RGY04Araip.B04142C不完整Incomplete110 Araip.R8WRMAraip.B04207－不完整Incomplete320 Araip.HD6QLAraip.B05316C完整Complete440 Araip.0MR1XAraip.B05315C完整Complete440 Araip.FX5SIAraip.B07316C完整Complete440 Araip.J58EQAraip.B08135C不完整Incomplete220 Araip.YGP4JAraip.B08315－完整Complete330 Araip.6KP6UAraip.B08295－完整Complete330 Araip.Y8EDRAraip.B08321－完整Complete440 Araip.X9BIGAraip.B10317C完整Complete440 Araip.Z0Q6QAraip.B10311C完整Complete430 Araip.WA456Araip.B10315C完整Complete430 Araip.RPP1MAraip.B10364－完整Complete220 Aradu.V26BDAradu.A03279C完整Complete440 Aradu.86DERAradu.A03286－不完整Incomplete430

C: 細(xì)胞質(zhì); －: 其他定位。

C: cytoplasm; －: other localization.

在各個小分支中, AnnAhs基本上都與雙子葉植物annexin聚在一起, 其中與大豆、苜蓿、向日葵親緣關(guān)系較近, 其次是擬南芥。個別AnnAhs與單子葉植物玉米和谷子聚在一起, 如Araip.WA456與玉米XP_008656201.2聚在一起, Araip.R8WRM與谷子XP_004986983.2聚在一起。這些分析結(jié)果顯示出AnnAhs家族成員的復(fù)雜性。

2.3 AnnAhs基因結(jié)構(gòu)分析

由于、.和.序列太短, 故只分析其余27個的基因結(jié)構(gòu)(圖2)。分析結(jié)果表明,基因序列中至少有2個內(nèi)含子, 最多有8個內(nèi)含子, 多數(shù)含有5~6個內(nèi)含子。.、.、.和.內(nèi)含子特別長, 而其外顯子序列與其他基因相差并不大, 保守性較強(qiáng)。

27個中有9對同源基因, 同源基因間具有類似的基因結(jié)構(gòu)(圖2)。如和.為一對同源基因, 它們都具有6個外顯子, 但是第3個內(nèi)含子長度差異較大。.和.分別具有4個和3個外顯子, 如果.第2個內(nèi)含子發(fā)生了滯留, 則會產(chǎn)生一個大外顯子, 該大外顯子與.第2個外顯子大小相同。

2.4 AnnAhs跨膜結(jié)構(gòu)域與保守結(jié)構(gòu)域分析

對AnnAhs進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析, 發(fā)現(xiàn)這30 個AnnAhs均無跨膜結(jié)構(gòu)域, 表明它們均為胞質(zhì)可溶性蛋白。

圖3顯示, 在motif2中有一個保守“isoleucine- arginine-isoleucine” motif, 即IRI基序[26], 27個AnnAhs均有IRI基序; 在motif4中有一個GXGT基序[27], 15個AnnAhs含有GXGT基序。

利用NCBI中Conserved domains 進(jìn)行分析(表1), 發(fā)現(xiàn)大多數(shù)AnnAhs有4個annexin結(jié)構(gòu)域, 即4個功能結(jié)構(gòu)域[22]。Aradu.SCC75、Aradu.23XWK、Aradu.N8MUP、Araip.YGP4J、Aradu.4J11T、Araip. 6KP6U、Aradu.KJ1YM和Araip.R8WRM各有3個, Aradu.MBZ2M、Araip.RPP1M、Araip.KR6F4各有2個。另外, Araip.KR6F4還含有2個不同的結(jié)構(gòu)域, 即ALDH_F10_BADH結(jié)構(gòu)域和Ribosomal_L18結(jié)構(gòu)域。前者屬于ALDH-SF超家族, 即醛脫氫酶家族, 具有氧化還原酶活性。后者是一個核糖體蛋白, 屬于L18家族, 在細(xì)胞中與RNA分子的核心結(jié)構(gòu)域結(jié)合, 以發(fā)揮功能。Araip.KR6F4有此2個結(jié)構(gòu)域說明該基因可能具有這方面的功能。

圖1 植物annexin蛋白聚類分析

紅色: 雙子葉植物; 綠色: 單子葉植物; 黑色: 低等植物; 黑色圓點(diǎn): AnnAhs。

Red: dicotyledonous; green: monocotyledonous; black: lower plants; black dot: AnnAhs.

2.5 AnnAhs亞細(xì)胞定位預(yù)測分析

對30個AnnAhs進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測分析顯示, 有16個AnnAhs定位于細(xì)胞質(zhì)(表1), 分別是Aradu.3L5NK、Araip.HD6QL、Aradu.WYZ5E、Araip.0MR1X、Aradu.SCC75、Araip.X9BIG、Aradu.9BC7H、Araip.FX5SI、Aradu.23XWK、Aradu.IZQ3Z、Araip.Z0Q6Q、Araip.WA456、Araip.J58EQ、Araip.RGY04、Araip.1LR8I和Aradu.V26BD, 其余14個定位不明確。

2.6 AnnAhs可變剪切分析

根據(jù)“豐花1號”轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的可變剪接情況(表2)表明, 有11個具有可變剪接現(xiàn)象, 占38%。共檢測到TSS、TTS、AE和ES四種可變剪接類型, 分別占15.4%、30.8%、30.8%和23.0%。沒有發(fā)現(xiàn)IR類型。在根中發(fā)生的可變剪切數(shù)目最多, 其次是葉中, 種子中最少, 顯示出的可變剪接在根系發(fā)育以及在應(yīng)對環(huán)境脅迫中的重要作用。在4個組織中均發(fā)生了可變剪接,.在3個組織中均發(fā)生了可變剪接, 其余9個只在1~2個組織中發(fā)生了可變剪接。

圖2 AnnAhs基因結(jié)構(gòu)分析

因部分無UTR, 故均用ORF進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析。

Some ofhave no UTRs, so theORF is used to analyze the gene structures.

2.7 AnnAhs表達(dá)模式分析

利用“豐花1號”轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中各基因的FPKM值對其表達(dá)模式進(jìn)行分析。其中.、.、.、.、.、.、.在4個組織中FPKM值均為0, 故不予分析。其余23個基因按照FPKM值作圖(圖4)表明, 各在不同組織中的表達(dá)量存在顯著差異。總體而言, 各在seed2和根中表達(dá)量較高, 其次是seed1, 在葉中表達(dá)量較低。其中.和在種子中特異性高表達(dá), 說明二者對種子發(fā)育的重要性。各基因在根中的表達(dá)量顯著高于葉中, 顯示出在根系發(fā)育中的重要作用。

3 討論

植物anneixn是一個龐大而保守的基因家族[28], 不僅在植物的生長發(fā)育中具有重要功能, 還參與抗寒、抗旱及耐鹽等多種反應(yīng)[29]。目前關(guān)于植物annexin應(yīng)對非生物脅迫的研究取得一定進(jìn)展, 但是其作用機(jī)制研究還比較少。本文主要利用花生基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對進(jìn)行全基因組系統(tǒng)分析, 可為研究的生理機(jī)制與功能提供一定的理論基礎(chǔ)。

在聚類分析中發(fā)現(xiàn), 植物annexin聚類關(guān)系比較復(fù)雜, 各類annexin間隔分布, AnnAhs穿插其中。AnnAhs基本上都與雙子葉植物annexin聚在一起, 個別AnnAhs與單子葉植物聚在一起, 說明AnnAhs家族基因的復(fù)雜性。Jami等[27]對149個植物annexin構(gòu)建進(jìn)化樹, 并將其分成9個組。并發(fā)現(xiàn), annexin多基因家族似乎隨著基因組的復(fù)雜而擴(kuò)大, 可能是與基因復(fù)制相關(guān), 而這種擴(kuò)增意味著該家族可能在植物應(yīng)對環(huán)境脅迫中具有重要作用[27,30]。花生是異源四倍體, 遺傳背景復(fù)雜, 在整個基因組中含有30個annexin基因, 比其他植物中annexin個數(shù)都要多, 可能是在進(jìn)化過程中通過復(fù)制形成的, 類似情況在苔蘚、大豆中也有報道[30-31]。

在保守結(jié)構(gòu)域分析中發(fā)現(xiàn)AnnAhs都含有 IRI基序, 大部分AnnAhs含有GXGT基序。有研究認(rèn)為 IRI 可以促成植物annexin與F-actin的結(jié)合, F-actin在植物生長發(fā)育過程中參與許多重要生命活動, 如細(xì)胞分泌、細(xì)胞分裂、細(xì)胞極性生長、細(xì)胞形態(tài)維持及物質(zhì)運(yùn)輸?shù)萚32]。含有IRI基序說明這部分annexin可能是通過F-actin而起作用的。在擬南芥annexin家族的8個成員中有3個(AtANN3、AtANN4和AtANN4)不含有IRI基序[33], 說明并不是所有成員都具有IRI 基序, 這部分annexin可能具有其他的調(diào)控方式。Araip.KR6F4比較特殊, 還含有ALDH _F10_BADH和Ribosomal_L18結(jié)構(gòu)域。這種現(xiàn)象在annexin蛋白家族中少見, Araip.KR6F4的功能也需要進(jìn)一步驗證與探究。

圖3 AnnAhs的保守結(jié)構(gòu)域分析

表2 AnnAhs可變剪切分析

TSS: 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)替換; TTS: 轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)替換; AE: 外顯子替換 5'或3'端剪接; ES: 外顯子跳躍。

TSS: transcription start site; TTS: transcription terminal site; AE: alternative exon ends (5', 3', or both); ES: exon skipping.

圖4 AnnAhs表達(dá)模式分析

亞細(xì)胞定位對研究蛋白質(zhì)功能具有重要作用[28,34], 植物annexin在細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜、內(nèi)膜系統(tǒng)以及核膜均有定位, 但是定位于細(xì)胞質(zhì)中的較多些, 可能與其家族蛋白基因在膜功能中起重要作用相關(guān)[15]。而且植物annexin的亞細(xì)胞定位與細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+濃度、細(xì)胞所處pH值以及外界環(huán)境均有關(guān)系[15-16]。擬南芥Ann At2、Ann At3和Ann At6定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核; Ann At5 定位于過氧化物酶體; Ann At7定位于細(xì)胞質(zhì)[33-34]。棉花中AnnGh3和AnnGh6定位于細(xì)胞質(zhì)[35]; MeAnn1定位于木薯體胚細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核[36]。小麥中的annexin在低溫脅迫下, 以p39和p22.5的形式定位于質(zhì)膜[37]。蒺藜苜蓿MtANN1定位于核膜[38]。芹菜VCaB42在 Ca2+存在時定位于液泡膜[19]。本研究中預(yù)測的AnnAhs大部分定位在細(xì)胞質(zhì)中, 少數(shù)部分定位不明確, 因此需要進(jìn)一步用實(shí)驗來驗證。這些結(jié)果暗示Annexin成員在不同的細(xì)胞生理過程和不同的環(huán)境條件下發(fā)揮不同作用。

可變剪接是調(diào)控真核生物轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組多樣性的重要分子機(jī)制, 也是一種在轉(zhuǎn)錄后 RNA 水平調(diào)控基因表達(dá)的重要機(jī)制, 在生物發(fā)育中具有重要作用[39]。本研究發(fā)現(xiàn)有11個在不同組織中發(fā)生了可變剪切, 這種現(xiàn)象在苔蘚、擬南芥和水稻的annexin中也有報道[27]。據(jù)統(tǒng)計, 單子葉植物annexin發(fā)生AS的情況較雙子葉植物多。水稻中2個annexin的轉(zhuǎn)錄本(Os09g23160, Os02g51750)發(fā)生了AS, 而玉米種至少有5個annexin基因發(fā)生AS。在雙子葉植物中, 擬南芥annexin (At5g65020, AnnAt2)發(fā)生AS。當(dāng)然, 關(guān)于AS調(diào)控annexin的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

表達(dá)模式對基因的功能研究具有重要作用。植物annexin在不同組織中的表達(dá)模式具有顯著差異。褚翠萍[14]對擬南芥中8個annexin基因的表達(dá)模式分析表明, Ann At1、Ann At6、Ann At7在幼苗、花和種子中都有表達(dá); Ann At2主要在子葉、胚軸和花萼中表達(dá); Ann At3主要在葉片、幼苗下胚軸和花萼中表達(dá); Ann At4 只在幼苗下胚軸表達(dá); Ann At5主要在幼苗胚軸和花絲中表達(dá); Ann At8 在葉片、花萼和種子中表達(dá); Ann At3、Ann At6、Ann At7、Ann At8 在保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)[34]。這種表達(dá)模式的差異反應(yīng)了不同annexin成員功能分工的差異。又有研究表明, 許多annexin是在根中發(fā)揮功能的。例如玉米annexin能夠加強(qiáng)玉米根冠原生質(zhì)體的胞吐作用[40]; Annexin P35在豌豆胚芽和根部的幼嫩區(qū)液泡細(xì)胞和根冠外圍分泌粘液細(xì)胞中含量最高[41]; 煙草Ntann12能夠調(diào)節(jié)根的極性運(yùn)輸[42];在根毛發(fā)育中可被細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)表達(dá)[43]。本研究表明, 除了7個沒有表達(dá)外, 剩余23個的表達(dá)模式各不相同, 但是總體而言它們在seed2和根中的表達(dá)水平較高, seed1次之, 而在葉片中的表達(dá)量最低。這說明不同成員的功能分工是不同的, 如.和.在seed1和seed2特異性高表達(dá), 顯示出二者對種子發(fā)育的重要性;.在根中的表達(dá)量最高, 表明其在根發(fā)育中具有重要作用; 不同在種子發(fā)育不同階段所起的作用也是不同的, 隨著種子發(fā)育的日趨成熟, 種子內(nèi)部各個器官逐漸分化出來, 越來越多的參與其中, 表達(dá)量也隨之增加。

4 結(jié)論

本文利用生物信息學(xué)方法探討了花生膜聯(lián)蛋白基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)域、保守結(jié)構(gòu)域與亞細(xì)胞定位的特點(diǎn), 并利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對其進(jìn)行了可變剪接以及表達(dá)模式分析, 為以后進(jìn)行花生膜聯(lián)蛋白基因的克隆與功能驗證提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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Structure and expression analysis of the members of peanut annexin gene family

WANG Hui-Min1, LI Xin-Guo2, WAN Shu-Bo3, ZHANG Zhi-Meng4, DING Hong4, LI Guo-Wei2,GAO Wen-Wei1,*, and PENG Zhen-Ying1,2,*

1Xinjiang Agricultural University, Wulumuqi 830052, Xinjang, China;2Research Center of Biotechnology, Shandong Academy of Agricultural Sciences / Shandong Key Laboratory of Crop Genetic Improvement and Ecology and Physiology, Jinan 250100, Shandong, China;3Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, Shandong, China;4Shandong Peanut Research Institute, Qingdao 266100, Shandong, China

Annexin is a kind of calcium-dependent phospholipid binding proteins involved in the regulation of plant metabolism, growth and development, drought resistance and salt tolerance, and its structure is species-specific in different plants. In order to have a systematic analysis of thegene family of peanut, we identified 30genes from the peanut genome database, and analyzed their characteristics using bioinformatics method. Peanut annexin (annexin of,) genes were unevenly distributed on 13 chromosomes, with 13 in A genome and 17 in B genome. There were 2 to 8 introns in the, with 5 to 6 introns in most. Phylogenetic analysis showed that the clustering relationship was complex. The annexins of lower plant, monocotyledonous and dicotyledonous plants were distributed at interval, with AnnAhs inserting in each branch. However, in each small branch, AnnAhswere basically clustered with the dicotyledonous plant annexins, and close to soybean, alfalfa and sunflower, followed byArabidopsis; but severalAnnAhs were associated with monocotyledonous and lower plant annexins. All 30 AnnAhs had no transmembrane domain, and 16 of them were located in cytoplasm, and the others’ localization was uncertain. Results of alternative splicing (AS) analysis ofshowed that only 11experienced AS, which accounted for about 38% of all; the AS events occurred most in roots, followed by leaves, and the least in seeds. The expression level ofwas high in seed2 and root, followed by seed1, and lower in leaf. The comprehensive analysis ofcan provide some theoretical support for peanut resistance breeding.

peanut; annexin; gene structure analysis; alternative splicing analysis; expression pattern analysis

2018-04-19;

2018-10-08;

2018-11-05.

10.3724/SP.J.1006.2019.84056

彭振英, E-mail: pengzhenying2005@126.com; 高文偉, E-mail: gww0911@163.com

E-mail: whuiminyspa@163.com

本研究由山東省自然科學(xué)基金重大基礎(chǔ)研究項目(植物根系耐鹽、抗旱、耐瘠薄的調(diào)控機(jī)理), 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項目(CXGC2018B05)和山東省自然科學(xué)基金項目(ZR2014YL043)資助。

This study was supported by the Major Basic Research Project of Shandong Natural Science Foundation, Shandong Academy of Agricultural Sciences Agricultural Science and Technology Innovation Project (CXGC2018B05), and Shandong Natural Science Foundation (ZR2014YL043).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20181101.1045.014.html