甘藍型油菜NRT1.5和NRT1.8家族基因的生物信息學分析及其對氮-鎘脅迫的響應(yīng)

梁桂紅 華營鵬 周 婷 廖 瓊 宋海星 張振華,*

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甘藍型油菜和家族基因的生物信息學分析及其對氮-鎘脅迫的響應(yīng)

梁桂紅1,2華營鵬1,2周 婷1,2廖 瓊1,2宋海星1,2張振華1,2,*

1湖南農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院, 湖南長沙 410128;2南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心, 湖南長沙 410128

植物對硝酸鹽的吸收和轉(zhuǎn)運需要硝酸鹽轉(zhuǎn)運體(nitrate transporters, NRTs)的協(xié)助。在擬南芥中, 硝酸鹽的長途轉(zhuǎn)運及其在根部和地上部的分配, 主要受家族的兩個成員和的協(xié)同調(diào)控, 且兩者的表達均受到硝酸鹽的強烈誘導。本文以和基因序列為基礎(chǔ)序列, 采用生物信息學方法鑒定了白菜、甘藍和甘藍型油菜中和同源基因, 并對基因結(jié)構(gòu)和分子特性、基因拷貝數(shù)變異、基因染色體分布、系統(tǒng)進化樹、蛋白保守序列比對和跨膜結(jié)構(gòu)域、基因響應(yīng)低氮和鎘脅迫的轉(zhuǎn)錄組測序以及基因共表達網(wǎng)絡(luò)進行了分析。結(jié)果表明, 白菜、甘藍及甘藍型油菜中NRT1.5和NRT1.8蛋白均含有保守的跨膜結(jié)構(gòu)域和保守基序(F-Y-L-A-L-N-L- G-S-L), 屬于MFS (major facilitator superfamily)超家族的小肽轉(zhuǎn)運體PTR (peptide transporter)家族。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明, 甘藍型油菜低氮處理72 h, 根部基因的表達豐度上調(diào)而抑制的表達; 鎘處理條件下, 乙烯/茉莉酸-硝酸鹽轉(zhuǎn)運體介導的信號途徑能夠促進表達上調(diào)而抑制的表達, 從而使更多的硝酸鹽從地上部運輸?shù)礁? 提高植物抗鎘脅迫的能力。本研究為進一步了解甘藍型油菜和家族基因的生物學功能及其對氮-鎘脅迫的響應(yīng)奠定基礎(chǔ), 同時為和家族基因在其他物種中的生物信息學研究提供參考。

甘藍型油菜; 生物信息學;;; 硝酸鹽; 鎘

氮(nitrogen, N)是植物生長發(fā)育所必需的大量營養(yǎng)元素, 廣泛參與生物體蛋白質(zhì)和核酸等大分子化合物的合成, 在生物體的物質(zhì)和能量代謝過程中起重要作用[1]。銨態(tài)氮(NH4+-N)和硝態(tài)氮(NO3–-N)是作物氮素吸收利用的主要形態(tài), 其中硝態(tài)氮是旱地作物吸收利用的主要氮源[2]。植物從土壤中吸收硝酸鹽是一個主動運輸?shù)倪^程, 其能量主要來源于質(zhì)子電化學勢梯度, 協(xié)助硝酸鹽轉(zhuǎn)運的載體稱為硝酸鹽轉(zhuǎn)運體(nitrate transporters, NRTs)[3], 包括低親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運體(nitrate transporter 1)和高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運體(nitrate transporter 2) 2個家族[4-5]。

硝酸鹽被植物根系細胞吸收后, 在植物體內(nèi)的分配主要有硝酸鹽短途分配(液泡硝酸鹽分配)和長途轉(zhuǎn)運(硝酸鹽在根部和地上部的轉(zhuǎn)運)兩種途徑, 它們共同調(diào)控著硝酸鹽的利用效率, 進而影響作物的氮素利用率(Nitrogen Use Efficiency, NUE)[6]。大部分的硝酸鹽在蒸騰拉力的作用下經(jīng)木質(zhì)部長途轉(zhuǎn)運, 將硝酸鹽分配到地上部的不同組織和器官中被同化和利用。該過程主要由向上運輸?shù)哪举|(zhì)部和向下運輸?shù)捻g皮部介導[7]。有研究證明, 擬南芥木質(zhì)部介導的硝酸鹽長途轉(zhuǎn)運及其在根和地上部的分配, 主要受家族的2個成員和的協(xié)同調(diào)控, 且二者的表達都受到硝酸鹽的強烈誘導[8-12]。主要在根部原生木質(zhì)部的中柱鞘細胞中表達, 負責將根部細胞質(zhì)中的硝酸鹽裝載進入木質(zhì)部以運往地上部分。當其功能缺失后, 突變體木質(zhì)部傷流液中的硝酸鹽含量降低, 植物向上轉(zhuǎn)運硝酸鹽的能力減弱[8]。在木質(zhì)部薄壁細胞表達, 通過調(diào)控硝酸鹽在木質(zhì)部的卸載進而影響硝酸鹽從根向地上部分的運輸[10]。由此可見,和基因的表達模式相反, 但共同影響硝酸鹽通過木質(zhì)部向地上部分的長途轉(zhuǎn)運, 進而影響作物的產(chǎn)量和氮素利用率。此外,和通過調(diào)控硝酸鹽在地上部和根部的分配, 從而影響植物對鎘脅迫的耐受能力。研究發(fā)現(xiàn)鎘處理條件下,基因的表達顯著上調(diào), 抑制的表達, 使更多的硝酸鹽從地上部運輸?shù)礁? 根部較高濃度的硝酸鹽有利于增強植株對鎘脅迫的耐受能力[10,13]。

在我國, 油菜作為一種重要的油料作物, 種植面積和總產(chǎn)量約占世界的1/3[14], 在有效供給油脂和改善生活結(jié)構(gòu)等方面起著重要作用。甘藍型油菜(L, AnAnCnCn, 約1345 Mb, 2= 4= 38)屬于十字花科蕓薹屬[15], 由白菜(, ArAr, ~485 Mb, 2= 2= 20)[16]和甘藍(CoCo, ~630 Mb, 2= 2= 18)[17]這2個二倍體基本種在7500年前通過天然遠緣雜交形成, 其全基因組包含約十萬多個蛋白編碼基因[18-19]。甘藍型油菜進化、遺傳的復雜性形成了其復雜的基因組, 在一定程度上影響了各種功能基因在甘藍型油菜生長和發(fā)育中的作用。

硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白負責植物根系對硝酸鹽的吸收和轉(zhuǎn)運, 一直是植物營養(yǎng)學領(lǐng)域研究的熱點之一。家族有53個家族成員, 目前, 其他作物中對于與硝酸鹽長途轉(zhuǎn)運的關(guān)系研究主要集中在小麥和水稻中, 但由于非模式植物研究的突變體材料和克隆基因技術(shù)的限制, 只在小麥中研究了和基因?qū)Φ{迫的響應(yīng)[20], 以及水稻中過表達材料的氮素生理特性[21], 對和基因的結(jié)構(gòu)功能及發(fā)育進化分析較少[22], 尤其在經(jīng)濟作物甘藍型油菜中的研究更少。

本研究利用和的基因序列和蛋白序列, 對甘藍型油菜中和基因進行鑒定和分析, 通過對基因生物信息數(shù)據(jù)的挖掘和整理, 分析該基因在白菜、甘藍和甘藍型油菜中的系統(tǒng)進化關(guān)系和保守基序特征, 預測其蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)等, 為進一步系統(tǒng)研究和基因在其他物種中的功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水培試驗所用的甘藍型油菜(L)品種為“湘油15號”, 油菜種子來自國家油料作物改良中心湖南分中心官春云院士團隊。

1.2 白菜、甘藍及甘藍型油菜NRT1.5和NRT1.8基因序列的數(shù)據(jù)來源及檢索

以擬南芥(AT1G32450)和(AT4G21680)的基因序列為種子序列, 利用BLAST搜索白菜、甘藍和甘藍型油菜中和的目的基因序列, 同時下載篩選到的基因序列對應(yīng)編碼的氨基酸序列, 將其保存為FASTA格式。本研究所用的數(shù)據(jù)庫包括擬南芥信息資源(TAIR)(https:// www.arabidopsis.org/)。白菜()、甘藍()及甘藍型油菜()基因組全長DNA序列、CDS序列、氨基酸序列及其注釋信息均從BRAD (http://brassicadb.org/brad/)數(shù)據(jù)庫下載[23]。胡楊的氨基酸序列從NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在線數(shù)據(jù)庫下載。高粱、水稻、粟、玉米等單子葉植物的氨基酸序列從JGI (https://phytozome.jgi.doe. gov/pz/portal.html#)在線數(shù)據(jù)庫下載。

1.3 白菜、甘藍及甘藍型油菜的基因命名

對三種蕓薹屬作物基因的命名以物種名稱+染色體(后綴.)+擬南芥中的同源基因。例如,代表甘藍型油菜中定位在A5染色體上的基因。

1.4 白菜、甘藍及甘藍型油菜NRT1.5和NRT1.8蛋白的分子特性分析

采用ExPASy ProtoParam (https://web.expasy. org/protparam/)[24]在線軟件預測白菜、甘藍和甘藍型油菜NRT1.5和NRT1.8蛋白的氨基酸數(shù)目和組成、相對分子量(MW)、理論等電點(pI)、蛋白質(zhì)的親水性(GRAVY)及穩(wěn)定性等理化性質(zhì)。

1.5 白菜、甘藍及甘藍型油菜NRT1.5和NRT1.8基因的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)特征

從擬南芥信息資源(TAIR)和BRAD數(shù)據(jù)庫中下載擬南芥、白菜、甘藍和甘藍型油菜的全長基因組DNA序列和編碼序列(CDS), 利用在線軟件GSDS 2.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)描繪內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)[25]。

1.6 白菜、甘藍及甘藍型油菜NRT1.5和NRT1.8基因的染色體定位分析

利用BLAST分別確定和在白菜、甘藍和甘藍型油菜中每條染色體上的起始位置, 并在GBrowse (http://brassicadb.org/cgi-bin/gbrowse/ Brassica/)中查找4個物種的各條染色體全長。利用軟件MapInspect v. 2010 (http://www.softsea.com/ review/MapInspect.html)繪制和在白菜、甘藍及甘藍型油菜中染色體的分布情況。一般認為, 在100-kb基因組范圍內(nèi)排列有2個或以上基因, 我們定義其為串聯(lián)重復基因[26]。

1.7 白菜、甘藍及甘藍型油菜NRT1.5和NRT1.8的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

提取3種蕓薹屬作物NRT1.5和NRT1.8蛋白的氨基酸序列, 利用軟件MEGA 7.0 (http://www. megasoftware.net/)[27]分別進行多重比對分析, 去除冗余序列[28]。采用鄰接法(Neighbor Joining, NJ)[29]對白菜、甘藍和甘藍型油菜NRT1.5和NRT1.8的比對蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, 并進行自檢, 設(shè)定Bootstrap重復為1000, 去除bootstrap支持率低于50%的節(jié)點。

1.8 白菜、甘藍及甘藍型油菜NRT1.5和NRT1.8蛋白的進化選擇壓力分析

為了研究NRT1.5和NRT1.8蛋白在物種進化過程中是否涉及到達爾文的選擇, 分別對擬南芥和白菜、甘藍和甘藍型油菜中NRT1.5和NRT1.8的CDS序列和蛋白序列進行比對, 利用在線軟件PAL2NAL (http://www.bork.embl.de/pal2nal/)計算核苷酸的同義突變頻率(synonymous, Ks)和非同義突變頻率(non-synonymous, Ka), 及其比值Ka/Ks。

1.9 白菜、甘藍及甘藍型油菜NRT1.5和NRT1.8蛋白的保守基序和跨膜結(jié)構(gòu)域預測分析

為了研究擬南芥和3種蕓薹屬作物中NRT1.5和NRT1.8蛋白的結(jié)構(gòu)差異, 利用軟件MEME v. 4.12.0 (http://meme-suite.org/tools/meme)[30]對蛋白質(zhì)的保守基序進行預測和分析。所用默認參數(shù), 最佳基序?qū)挾葹?~50 bp, 基序最大數(shù)為15。利用在線軟件NovoPro (http://www.novopro.cn/tools/color_align_ prop.html)進行蛋白保守序列分析。同時利用在線軟件TMpred Server (https://embnet.vital-it.ch/software/ TMPRED_form.html)對甘藍型油菜的NRT1.5和NRT1.8蛋白序列進行跨膜結(jié)構(gòu)域的預測和分析[31]。

1.10 甘藍型油菜NRT1.5和NRT1.8基因在氮-鎘脅迫條件下的表達分析

1.10.1 甘藍型油菜的培養(yǎng)條件 油菜苗期培養(yǎng)試驗在光照培養(yǎng)室中, 其溫度22℃, 光照周期14 h (光照)/10 h (黑暗), 光照強度300~320 μmol m–2s–1, 濕度60%~75%。選取大小一致的油菜種子, 使用75%的酒精殺菌處理10 min, 用超純水將種子表面沖洗干凈后, 4℃下用無菌水浸泡24 h, 期間換水5~6次。將浸泡后的種子均勻播種在塑料育苗盤表面固定的紗布上, 育苗盤中加適量超純水。育苗7 d后, 將長勢一致的幼苗移栽到盛有4 L營養(yǎng)液的黑色塑料盒中。營養(yǎng)液濃度為Hoagland完全營養(yǎng)液[32]的1/4。

1.10.2 低氮處理高通量轉(zhuǎn)錄組測序試驗 油菜幼苗以硝態(tài)氮為唯一氮源, 在6.0 mmol L–1NO3–中培養(yǎng)10 d后, 轉(zhuǎn)移至0.3 mmol L–1NO3–條件下處理0、3和72 h, 對地上部(S)和根(R)取樣, 將每個樣品單獨分裝到干凈的離心管中, 并作好標記, 在液氮中速凍, –80℃冰箱中保存待測, 每個處理作3個獨立的生物學重復。測序平臺為Illumina Hiseq 4000[33], 每個樣品產(chǎn)生6.0 Gb測序數(shù)據(jù), 兩端配對末端(PE)讀數(shù), 由RNA-seq數(shù)據(jù)確定[34]轉(zhuǎn)錄組豐度(FPKM值)。

1.10.3 鎘處理高通量轉(zhuǎn)錄組測序試驗 油菜幼苗在無鎘的正常營養(yǎng)液中培養(yǎng)10 d后, 將油菜樣品分成兩組, 一組繼續(xù)在正常營養(yǎng)液中培養(yǎng), 另一組轉(zhuǎn)移至含10 μmol L–1鎘的營養(yǎng)液中處理6 h, 分別對兩組樣品的地上部(S)和根(R)取樣, 將每個樣品單獨分裝到干凈的離心管中, 作好標記。樣品的高通量轉(zhuǎn)錄組測序試驗參照步驟1.10.2。

2 結(jié)果與分析

2.1 白菜、甘藍及甘藍型油菜NRT1.5和NRT1.8基因/蛋白的分子特性

利用和數(shù)據(jù)在甘藍型油菜全基因組數(shù)據(jù)庫中分別檢索到8條和8條同源基因序列(表1和表2)。白菜、甘藍和甘藍型油菜的NRT1.5蛋白均由22種氨基酸組成, 其中Leu和Ser的含量最高?；蚓幋a區(qū)長度在1236 bp ()~1863 bp ()之間, 編碼411~620個氨基酸, 預測蛋白質(zhì)的理論分子量為45.80~69.41 kD。8個NRT1.5蛋白中酸性氨基酸(Asp+Glu)個數(shù)均多于堿性氨基酸(Arg+Lys), 等電點(pI)范圍在5.63~6.35, 為酸性蛋白。Guruprasad等[35]認為, 蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)大于40時為不穩(wěn)定蛋白。NRT1.5蛋白的不穩(wěn)定性系數(shù)在27.54~34.68間, 均小于40, 屬于穩(wěn)定性蛋白。氨基酸的親水性指數(shù)(GRAVY)是氨基酸的化學特性, 是描述其支鏈的親水性或疏水性程度的值, 根據(jù)親水性指數(shù)介于–0.5~0.5為兩性蛋白(GRAVY為負值表示親水性, 正值表示疏水性)的原則[36], 氨基酸的親水性指數(shù)在–0.006 (BolC5.NRT1.5b)~0.096 (BraA5.NRT1.5)之間, 表明NRT1.5主要為兩性蛋白。脂肪指數(shù)在86.13 (BolC5.NRT1.5b)~89.77 (BnaC5.NRT1.5b)之間。

NRT1.8蛋白在白菜、甘藍和甘藍型油菜中均由22種氨基酸組成。其中除了BraA3.NRT1.8、BolC6.NRT1.8和BnaA3.NRT1.8三種蛋白的Leu和Ala含量較高外, 其余五種蛋白均是Leu和Ser的含量較高。除(897 bp)和(1167 bp)外,的基因編碼區(qū)均為1752 bp, 編碼583個氨基酸, 分子量分布在64.55 kD (BraA3. NRT1.8)~64.72 kD (BraA1.NRT1.8)之間。3個NRT1.8蛋白(BolC6.NRT1.8、BnaA3.NRT1.8和BnaC7.NRT1.8)中Arg+Lys>Asp+Glu, pI分別為8.18、7.52和8.18, 為堿性蛋白; BraA3.NRT1.8中Arg+Lys和Asp+Glu均為51, pI為7.06, 為中性蛋白; 其余４個NRT1.8蛋白中Asp+Glu>Arg+Lys, 為酸性蛋白。蛋白的不穩(wěn)定性系數(shù)在18.64 (BolC6.NRT1.8)~ 32.07 (BnaCn.NRT1.8)之間, 為穩(wěn)定性蛋白。GRAVY介于0.088 (BolC6.NRT1.8)~0.218 (BraA3.NRT1.8)之間, 為雙親和蛋白。脂肪指數(shù)在87.96 (BnaCn. NRT1.8)~94.85 (BnaC7.NRT1.8)之間。本研究中3種蕓薹屬作物NRT1.5和NRT1.8蛋白中Leu的含量均較高, 均為穩(wěn)定的雙親和蛋白。

表1 白菜、甘藍和甘藍型油菜NRT1.5和NRT1.8基因的分子特性

(續(xù)表1)

基因名Gene name基因編號Gene ID分區(qū)Block亞類Subgenome物理位置Physical position編碼區(qū)長度CDS (bp)外顯子/內(nèi)含子Exon/intron BnaC5.NRT1.5aBnaC05g28620DBMF226898087–2690321318456/5 BnaC5.NRT1.5bBnaC05g24580DBLF19037761–1904190018606/5 NRT1.8 BraA1.NRT1.8Bra013547ULF6243271–624529817524/3 BraA3.NRT1.8Bra038763UMF124230588–2423259417524/3 BolC1.NRT1.8Bol028440ULF8086050–808807517524/3 BolC6.NRT1.8Bol024295UMF142081659–420827298973/2 BnaA1.NRT1.8BnaA01g11510DULF5715790–571812617524/3 BnaA3.NRT1.8BnaA03g44820DUMF122774854–2277686217524/3 BnaC7.NRT1.8BnaC07g36810DUMF138737319–3873932517524/3 BnaCn.NRT1.8BnaCnng78690DULF80520183–8052181611673/2

表2 白菜、甘藍和甘藍型油菜NRT1.5和NRT1.8蛋白的分子特性

2.2 白菜、甘藍、甘藍型油菜及擬南芥NRT1.5和NRT1.8的基因拷貝數(shù)變異、染色體定位及基因結(jié)構(gòu)分析

以擬南芥和的基因序列為基礎(chǔ)序列, 對在油菜全基因組數(shù)據(jù)庫中檢索到的8個和8個同源基因的拷貝數(shù)變異、染色體定位及基因結(jié)構(gòu)特征進行如下分析。

拷貝數(shù)變異(copy number variations, CNVs)是由基因組發(fā)生重排所致。為了比較白菜、甘藍及甘藍型油菜和基因的進化多樣性, 分別以和為查詢對象, 在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST搜索。圖1顯示, 在異源四倍體甘藍型油菜中鑒定了4個和4個同源基因, 明顯多于擬南芥、甘藍和白菜所具有的和基因數(shù)量。甘藍型油菜中基因的數(shù)量與甘藍和白菜中的總數(shù)相同,基因的數(shù)量等同于甘藍和白菜中的總數(shù), 這意味著甘藍型油菜和基因在異源多倍體自然加倍過程中沒有損失。

利用MapInspect軟件繪制出和基因在擬南芥、白菜、甘藍及甘藍型油菜染色體上的定位圖(附圖1)。表明和基因分布在不同的染色體上?；蛟谌旧w上的分布是不均勻的, 每條染色體上有1~2個基因。Ar5、Ar9、An5和An9各分布1個; Co5和Cn5各分布2個串聯(lián)重復基因。異源四倍體甘藍型油菜中的A染色體全部來源于親本二倍體白菜, C染色體全部來源于親本二倍體甘藍, 說明NRT1.5蛋白在自然加倍的進化過程中相對保守。與基因在染色體上的分布相比,基因在蕓薹屬作物染色體上的分布相對均勻, Ar1和Ar3、Co1和Co6以及An1、An3和Cn7每條染色體上各有一個基因。

外顯子–內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的數(shù)目是某些基因家族中典型的進化印記[37]。因此, 利用GSDS 2.0軟件對蕓薹屬作物和擬南芥中和的基因結(jié)構(gòu)進行分析(圖2)。白菜和甘藍的基因均有4個內(nèi)含子, 甘藍型油菜有5個內(nèi)含子, 與擬南芥的基因結(jié)構(gòu)類似。除和有2個內(nèi)含子外, ３種蕓薹屬作物基因均含3個內(nèi)含子。同源基因中內(nèi)含子個數(shù)的不同在一定程度上表明了即使是直系同源基因也有可能經(jīng)歷基因結(jié)構(gòu)的多樣化。

圖1 白菜、甘藍、甘藍型油菜及擬南芥NRT1.5和NRT1.8基因的拷貝數(shù)變異

柱狀圖頂部數(shù)值為該物種拷貝的基因數(shù)目。

The number at the top of the histogram is the number of genes copied for that species.

圖2 白菜、甘藍、甘藍型油菜及擬南芥NRT1.5和NRT1.8的基因結(jié)構(gòu)特征

圖a表示擬南芥、白菜、甘藍及甘藍型油菜的基因結(jié)構(gòu)特征; 圖b表示擬南芥、白菜、甘藍及甘藍型油菜的基因結(jié)構(gòu)特征。其中, 黃色部分代表CDS序列, 藍色部分代表上游基因和下游基因, 黑色細線代表基因的內(nèi)含子。

Fig. a and Fig. b show the gene structure characteristics ofandrespectively in,,,andThe yellow parts represent the CDS sequence and the blue parts represent the upstream and downstream genes. The black lines represent the intron of genes.

2.3 不同物種NRT1.5和NRT1.8蛋白的系統(tǒng)進化分析

為了比較NRT1.5和NRT1.8蛋白在不同物種發(fā)育進化過程中的分子進化規(guī)律和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)聯(lián), 分別對擬南芥、甘藍型油菜、胡楊等5個雙子葉物種和水稻、玉米、高粱等5個單子葉物種的32個NRT1.5和33個NRT1.8蛋白序列進行同源性比對, 利用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖3)。圖3所示, NRT1.5和NRT1.8家族成員均分為雙子葉植物和單子葉植物兩個分支, 表明NRT1.5和NRT1.8這兩種蛋白均在生物形態(tài)發(fā)生后開始出現(xiàn)差異[36]。白菜、甘藍和油菜中NRT1.5和NRT1.8兩種蛋白均位于雙子葉的分支, 且非常緊密地聚集在一起, 同源性較高。

圖3 不同物種NRT1.5和NRT1.8蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

圖a表示在雙子葉和單子葉植物中NRT1.5蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系; 圖b表示在雙子葉和單子葉植物中NRT1.8蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。其中, 綠色部分代表雙子葉植物, 包括擬南芥、白菜、甘藍、甘藍型油菜和胡楊, 紅色部分代表單子葉植物, 包括高粱、水稻、小米、玉米和二穗短柄草。

Fig.a and Fig.b show the phylogenetic relationships of NRT1.5 and NRT1.8 proteins respectively in dicots and monocotsThe green parts represent the dicots, including,andThe red parts represent the monocots, including,,,, and.

2.4 白菜、甘藍及甘藍型油菜NRT1.5和NRT1.8蛋白的進化選擇壓力分析

十字花科蕓薹屬作物全基因組可分為LF, MF1和MF2[38]3個亞基因組。表1顯示, NRT1.5蛋白定位在B分區(qū), 其中50%為LF亞基因組, 50%為MF2亞基因組。NRT1.8蛋白定位在U分區(qū), 分為LF和MF1兩個亞基因組。

為了研究NRT1.5和NRT1.8蛋白在物種進化過程中是否受到選擇壓力, 分別對擬南芥和3種蕓薹屬作物NRT1.5和NRT1.8的CDS序列及蛋白序列進行比對, 分別計算Ka、Ks和Ka/Ks。在遺傳學中認為, 用Ka/Ks可以判斷這個基因在進化中是否受到選擇壓力。當Ka/Ks>1.0時, 認為有正選擇效應(yīng); 當Ka/Ks=1.0時, 認為該蛋白存在中性選擇; 當Ka/Ks<1.0時, 則認為存在純化選擇作用[39]。圖4所示, NRT1.5和NRT1.8在3種蕓薹屬作物中的Ka/Ks值均小于1.0, 表明這兩種蛋白在物種進化過程中保留其重要功能而存在純化選擇作用。

2.5 白菜、甘藍、甘藍型油菜及擬南芥NRT1.5和NRT1.8蛋白的保守基序分析

不同物種硝酸鹽轉(zhuǎn)運體的蛋白序列高度同源, 具有相似的保守序列。在擬南芥中,家族屬于MFS (major facilitator superfamily)的小肽轉(zhuǎn)運體PTR (peptide transporter)家族。PTR轉(zhuǎn)運蛋白一般含有450~600個氨基酸和12個跨膜區(qū)。在第5跨膜區(qū)有一個PTR家族的保守序列(F-Y-x-x-x-N-x-G-S- L)[40]。對3種蕓薹屬作物及擬南芥NRT1.5和NRT1.8的氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn), 4個物種NRT1.5和NRT1.8蛋白的氨基酸序列相似性很高, 蛋白結(jié)構(gòu)保守, 均含有PTR家族的保守基序(F-Y-L-A-L-N-L-G-S- L)(圖5-a和圖5-b藍色虛線區(qū)域)。利用在線軟件MEME對蕓薹屬作物及擬南芥NRT1.5和NRT1.8蛋白的保守基序進行分析, 不同顏色的盒子表示不同的保守基序, 灰色的線條表示沒有檢測到基序的蛋白質(zhì)區(qū)域。圖6-a顯示, NRT1.5蛋白在4個物種中相對保守, 保守基序為10~15個。其中, 甘藍型油菜和擬南芥中NRT1.5蛋白非常保守, 保守基序均為15個; BraA9.NRT1.5、BraA5.NRT1.5和BolC5.NRT1.5a缺失Motif 1, 含有14個保守基序; BolC5.NRT1.5b有10個保守基序, 缺失Motif 1、Motif 9、Motif 10、Motif 13及Motif 14。圖6-b所示, 4個物種NRT1.8蛋白的保守基序為7~15個, 均含有保守基序Motif 6和Motif 7。其中BraA1.NRT1.8、BraA3.NRT1.8、BnaA1.NRT1.8、BnaA3.NRT1.8、BnaC7.NRT1.8及BolC1.NRT1.8的保守基序為15個; AtNRT1.8、BnaCn.NRT1.8和BolC6.NRT1.8保守基序分別為14、10和7個。從分子進化的角度看, 氨基酸殘基在進化過程中的保守性, 可以認為其在功能或結(jié)構(gòu)上具有重要性[41]。

圖4 白菜、甘藍及甘藍型油菜中NRT1.5和NRT1.8蛋白的同義突變頻率(Ks)和非同義突變頻率(Ka)

圖a, b, c分別表示白菜、甘藍及甘藍型油菜NRT1.5蛋白的同義突變頻率和非同義突變頻率; 圖d, e, f分別表示白菜、甘藍及甘藍型油菜NRT1.8蛋白的同義突變頻率和非同義突變頻率;

Fig. a, Fig. b, and Fig. c show synonymous nucleotide substitution rates and non-synonymous nucleotide substitution rates of NRT1.5 proteins in,, and,respectively. Fig. d, Fig. e, and Fig. f show synonymous nucleotide substitution rates and non-synonymous nucleotide substitution rates of the NRT1.8 proteins in,, and, respectively.

圖a表示擬南芥、白菜、甘藍及甘藍型油菜NRT1.5蛋白的保守序列比對; 圖b表示擬南芥、白菜、甘藍及甘藍型油菜NRT1.8蛋白的保守序列比對。其中, 藍色虛線部分表示PTR家族的保守序列(F-Y-L-A-L-N-L-G-S-L)。

Fig. a and Fig. b show the conservative sequence alignment of NRT1.5 and NRT1.8 proteins respectively in,,, and. The blue parts show the conservative sequence (F-Y-L-A-L-N-L-G-S-L) of peptide transporter.

2.6 甘藍型油菜NRT1.5和NRT1.8蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析

擬南芥家族的蛋白含12個跨膜區(qū), 且在第6、7跨膜區(qū)之間有一個由約100個氨基酸組成的大親水環(huán)相連, 將12個跨膜區(qū)分成兩部分[42]。BnaNRT1.5和BnaNRT1.8家族蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域如圖7所示, 除了BnaCn.NRT1.8含有7個跨膜結(jié)構(gòu)域外(圖7-h), NRT1.5和NRT1.8均含有12個跨膜結(jié)構(gòu)域, 在第6~7跨膜區(qū)間由一個大的親水環(huán)相連, 與擬南芥中家族的結(jié)構(gòu)特點相似。NRT1.5蛋白跨膜區(qū)主要分布在第41~580氨基酸殘基間, 12個跨膜結(jié)構(gòu)域長度為17~29個氨基酸。BnaA1.NRT1.8、BnaA3.NRT1.8和BnaC7.NRT1.8蛋白的跨膜區(qū)位于第35~565個氨基酸殘基間, 跨膜結(jié)構(gòu)域長度為17~27個氨基酸。BnaCn.NRT1.8蛋白的跨膜區(qū)分布在260~370氨基酸之間, 跨膜結(jié)構(gòu)域長度為17~22個氨基酸。

圖6 白菜、甘藍、甘藍型油菜及擬南芥NRT1.5和NRT1.8蛋白的保守基序特征

圖a, d分別表示NRT1.5和NRT1.8蛋白在擬南芥、白菜、甘藍及甘藍型油菜中的系統(tǒng)進化關(guān)系; 圖b, e分別表示NRT1.5和NRT1.8蛋白在擬南芥、白菜、甘藍及甘藍型油菜的保守基序; 圖c, f分別表示NRT1.5和NRT1.8蛋白中每個保守基序的序列。

Fig. a and Fig. d show the phylogenetic relationships of NRT1.5 and NRT1.8 proteins respectively in,,, and. Fig. b and Fig. e show the motives of NRT1.5 and NRT1.8 proteins respectively in,,, and. Fig. c and Fig. f show the sequence of conserved motif of NRT1.5 and NRT1.8 proteins.

圖7 甘藍型油菜NRT1.5和NRT1.8蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域

圖a~d表示甘藍型油菜中4個NRT1.5蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域, 其中a表示Bna.A5.NRT1.5, b表示Bna.A9.NRT1.5, c表示Bna.C5.NRT1.5a, d表示Bna.C5.NRT1.5b。圖e~h表示甘藍型油菜中4個NRT1.8蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域, 其中a表示Bna.A1.NRT1.8, f表示Bna.A3.NRT1.8, g表示Bna.C7.NRT1.8, h表示Bna.Cn.NRT1.8。

Fig. a to Fig. d show four transmembrane domains of NRT1.5 protein in. Fig. a, Fig. b, Fig. c, and Fig. d show the protein of Bna.A5.NRT1.5, Bna.A9.NRT1.5, Bna.C5.NRT1.5a, and Bna.C5.NRT1.5b, respectively. Fig. e to Fig. h show four transmembrane domains of NRT1.8 protein in. Fig. e, Fig.f, Fig. g, and Fig. h show the protein of Bna.A1.NRT1.8, Bna.A3.NRT1.8, Bna.C7.NRT1.8, and Bna.Cn.NRT1.8, respectively.

2.7 油菜NRT1.5和NRT1.8基因在氮-鎘脅迫條件下基因表達豐度和基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析

硝酸鹽不僅是重要的營養(yǎng)物質(zhì), 同時也是一種重要的信號分子, 對硝酸鹽轉(zhuǎn)運體發(fā)揮功能起重要的調(diào)控作用[43]。為了確定和對低氮脅迫是否存在響應(yīng), 對短期(3 h)和長期(72 h)低氮處理的甘藍型油菜地上部和根進行了高通量轉(zhuǎn)錄組分析(圖8)。表明低氮處理0~72 h后, 甘藍型油菜中和基因在根部的表達均受到顯著影響, 地上部差異不大。低氮處理后基因在根部的表達豐度上調(diào), 且在72 h時達到最大值。其中,和表達量在0~3 h內(nèi)上調(diào), 3~72 h內(nèi)趨于平緩。和表達量高, 且在0~72 h內(nèi)持續(xù)上調(diào)。從甘藍型油菜基因的共表達分析網(wǎng)絡(luò)中可以看出,在響應(yīng)低氮脅迫中均起到調(diào)控作用, 其中基因的調(diào)控占主導作用, 且與的功能互作較強。低氮處理同樣會影響的表達。根部低氮處理0~72 h, 其基因表達量呈下調(diào)的趨勢, 在0~3 h內(nèi)急劇下調(diào), 3~72 h內(nèi)下調(diào)較緩慢, 在72 h表達量最低。其中, 低氮誘導相同的時間,和的表達量均高于。基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析也表明,和在響應(yīng)低氮脅迫中均起調(diào)控作用, 其中前者起主導作用。

甘藍型油菜湘油15號在10 μmol L–1的鎘脅迫條件下, 根部和地上部基因的表達均受到抑制(圖9-a, b), 基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析表明(圖9-c),和在鎘脅迫條件下均起到調(diào)控作用, 其中起主導調(diào)控作用。根部在鎘脅迫下受到顯著誘導,和在此過程中均起到調(diào)控作用, 其中起主要作用,和之間的功能互作較強(圖9-d, e, f)。

甘藍型油菜根部和基因在低氮和鎘脅迫條件下的表達量均受到不同程度的誘導。低氮脅迫條件下,基因的表達豐度上調(diào)抑制基因的表達, 使更多的硝酸鹽從根部運輸?shù)降厣喜勘蛔魑锿屠? 從而提高植物的氮素利用率。植物受到鎘脅迫時,基因的表達上調(diào)抑制基因的表達, 從而使更多的硝酸鹽運輸?shù)礁? 根部高濃度的硝酸鹽有利于提高植物的脅迫防御能力。

圖8 甘藍型油菜NRT1.5和NRT1.8基因?qū)Φ偷捻憫?yīng)及基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析

圖a表示甘藍型油菜地上部和根部家族基因在低氮處理0 h、3 h、72 h 時的基因表達豐度; 圖b表示家族基因在低氮處理時的基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析。圖c表示甘藍型油菜地上部和根部家族基因在低氮處理0 h、3 h、72 h 時的基因表達豐度; 圖d表示家族基因在低氮處理時的基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析; FPKM表示每千個堿基轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的fragments。

Fig. a shows the gene expression abundance offamily genes in shoots and roots ofwith low nitrate treatment for 0 h, 3 h, 72 h. Fig. b shows the co-expression network analysis offamily genes with low nitrate treatment. Fig. c shows the gene expression abundance offamily genes in shoots and roots ofwith low nitrate treatment for 0 h, 3 h, 72 h. Fig. d shows the co-expression network analysis offamily genes with low nitrate treatment. FPKM means the fragments per kilobase of exon model per million mapped reads.

圖9 甘藍型油菜NRT1.5和NRT1.8基因?qū)︽k脅迫的響應(yīng)及基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析

圖a和圖b分別表示甘藍型油菜地上部和根部家族基因在鎘處理時的基因表達豐度; 圖c表示家族基因在鎘處理時的基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析。圖d和圖e分別表示甘藍型油菜地上部和根部家族基因在鎘處理時的基因表達豐度; 圖f表示家族基因在鎘處理時的基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析。FPKM表示每千個堿基轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的fragments。圖中所示顯著性差異是單個基因?qū)φ蘸玩k處理兩兩對比, 未達到顯著性差異的圖中未標記。誤差線代表3個獨立生物學重復的標準誤, a和b表示差異顯著(< 0.05)。

Fig. a and Fig. b show the gene expression abundance offamily genes in shoots and roots ofwith cadmium stress. Fig. c shows the co-expression network analysis offamily genes with cadmium stress. Fig. d and Fig. e show the gene expression abundance offamily genes in shoots and roots ofwith cadmium stress. Fig. f shows the co-expression network analysis offamily genes with cadmium stress. FPKM means the fragments per kilobase of exon model per million mapped reads. The significant difference shown in the figure is the pairwise comparison between control and cadmium treatment, and the figure without significant difference is not marked. Data are shown as means±SE (= 3) and the different lowercases above text are used to show statistical significance (< 0.05).

3 討論

植物吸收和轉(zhuǎn)運硝酸鹽需要硝酸鹽轉(zhuǎn)運體(NRTs)的協(xié)助完成。在擬南芥中,家族有53個成員, 目前鑒定有8個成員()在硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運中各自發(fā)揮著獨特的作用[3,8,42,44-45], 其中和在調(diào)控硝酸鹽長途轉(zhuǎn)運及其根系和地上部的分配中起著重要的作用。白菜、甘藍和甘藍型油菜作為十字花科蕓薹屬中3種重要的經(jīng)濟作物, 對其和基因的結(jié)構(gòu)功能及進化分析研究具有重要的實際意義。

擬南芥家族屬于MFS (major facilitator superfamily)超家族的小肽轉(zhuǎn)運體PTR (peptide transporter)家族。PTR轉(zhuǎn)運蛋白是一類可以轉(zhuǎn)運氨基酸、寡肽以及硝酸鹽等含氮化合物的膜轉(zhuǎn)運蛋白, 廣泛存在于動物、植物和微生物中[46], 一般含450~ 600個氨基酸, 12個跨膜區(qū), 在第6、第7跨膜區(qū)之間由一個約100個氨基酸組成的親水環(huán)相連, 在第5跨膜區(qū)有一個PTR家族的保守基序(F-Y-x-x-x-N- x-G-S-L)。3種蕓薹屬作物中大部分NRT1.5和NRT1.8蛋白含411~620個氨基酸, 跨膜結(jié)構(gòu)域分析顯示有12個跨膜區(qū), 且在第6~7跨膜區(qū)間有一個親水環(huán)。蛋白保守序列比對和保守基序分析發(fā)現(xiàn), 2個蛋白均含有PTR家族的保守基序(F-Y-L-A-L-N-L- G-S-L), 與擬南芥家族基因相似。一般認為, 含有多個內(nèi)含子的基因比較保守, 而不含有內(nèi)含子的基因保守性較差[47-48]。3種蕓薹屬作物和基因結(jié)構(gòu)含有2~5個內(nèi)含子, 分別屬于B分區(qū)不同亞類(LF、MF2)和U分區(qū)不同亞類(LF、MF1)。系統(tǒng)進化樹和Ka/Ks表明蛋白在不同物種發(fā)育進化過程中的同源性和進化過程中是否受到選擇壓力[39]。蕓薹屬作物NRT1.5蛋白同源性較高, Ka/Ks值均小于1.0, 表明NRT1.5在3個物種進化過程中存在純化選擇作用且發(fā)揮相似的功能。NRT1.8蛋白Ka/Ks值均小于1.0, 但同源性較低, 表明NRT1.8在物種系統(tǒng)進化中受到純化選擇壓力, 但在不同物種進化過程中其功能可能存在一定差異。

硝酸鹽是氮素儲存和運輸?shù)闹匾问? 同時作為一種重要的信號物質(zhì)對硝酸鹽轉(zhuǎn)運體起到重要的調(diào)控作用。植物通過硝酸鹽轉(zhuǎn)運體感知土壤中硝酸鹽的濃度, 誘導硝酸鹽轉(zhuǎn)運體家族的不同成員發(fā)揮作用[43]。Wang等[49]指出, 在不同氮水平下小麥根系硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的不同成員基因表達存在差異, 從而使植株更有效地利用養(yǎng)分。此外, 硝酸鹽轉(zhuǎn)運體在植物脅迫防御方面發(fā)揮著重要作用。研究表明, 在逆境脅迫條件下,和通過調(diào)控硝酸鹽在根部和地上部的分配從而影響植物對逆境脅迫的耐受能力。乙烯/茉莉酸-硝酸鹽轉(zhuǎn)運體介導的信號途徑通過促進表達上調(diào)而抑制的表達, 從而使更多的硝酸鹽從地上部運輸?shù)礁? 進而提高植物抗逆境脅迫的能力[10-11]。本研究中, 油菜湘油15號根部在低氮處理0~72 h時,基因的表達豐度顯著上調(diào), 而基因的表達豐度呈現(xiàn)下調(diào)趨勢, 由此可見,和兩個基因在響應(yīng)低氮條件下誘導產(chǎn)生的基因表達模式相反,但共同影響硝酸鹽通過木質(zhì)部向地上部的長途轉(zhuǎn)運, 進而影響作物的產(chǎn)量和氮素利用率。在10 μmol L–1鎘處理條件下, 甘藍型油菜中表達上調(diào)抑制基因的表達, 這與Li等[10]研究的擬南芥基因?qū)︽k脅迫的響應(yīng)一致。顯著上調(diào)使更多的硝酸鹽從地上部分運輸?shù)礁? 根部較高濃度的硝酸鹽有利于根系適應(yīng)鎘脅迫。Li等[10]的研究也表明, 隨著培養(yǎng)液中鎘濃度的適當增加,中的硝酸鹽含量較野生型顯著降低, 這說明在根部運輸硝酸鹽的過程中,基因的表達受鎘的正向調(diào)控?；蚬脖磉_網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn), 油菜在適應(yīng)低氮脅迫時是和起主要調(diào)控作用, 鎘脅迫時發(fā)揮主導作用的是和, 這可能是因為和基因?qū)Φ玩k脅迫的響應(yīng)程度不同, 由此可以推斷這2個基因家族在抵抗非生物脅迫過程中可能扮演著不同的角色, 但不可否認的是和基因在植物適應(yīng)氮-鎘脅迫方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。因此, 深入全面地了解和的基因結(jié)構(gòu)和進化關(guān)系對更好地發(fā)揮其功能具有重要的意義, 同時也為這2個家族基因在其他物種中的功能研究提供依據(jù)。

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附圖1 NRT1.5和NRT1.8基因在白菜、甘藍、甘藍型油菜及擬南芥中的染色體定位

圖a表示基因在擬南芥、甘藍型油菜、甘藍及白菜中的染色體定位；圖b表示基因在擬南芥、甘藍型油菜、甘藍及白菜中的染色體定位。

Fig. a shows the chromosomal localization ofgenes in,and. Fig. b shows the chromosomal localization ofgenes inand.

Bioinformatics analysis and response to nitrate-cadmium stress ofandfamily genes in

LIANG Gui-Hong1,2, HUA Ying-Peng1,2, ZHOU Ting1,2, LIAO Qiong1,2, SONG Hai-Xing1,2, and ZHANG Zhen-Hua1,2,*

1College of Resource and Environment, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, Hunan, China;2Southern Regional Collaborative Innovation Center for Grain and Oil Crops in China, Changsha 410128, Hunan, China

The absorption and transportation of nitrate in plants require the assistance of nitrate transporters (NRTs). The expression of two members of thefamily, includingandgenes was strongly induced by nitrateandregulated the long-distance transport and distribution of nitrate between roots and shoots in.andhomologous genes in,, andwere identified by bioinformatics with the basic sequences ofandand analyzed in gene structures and proteins molecular characterization, gene copy number variations, chromosome locations, evolutionary relationship tree, proteins conservative sequence alignment and the transmembrane domains.andresponsive to the low concentration nitrate and cadmium stress were also determined by transcriptome analysis and co-expression network analysis, showing that NRT1.5 and NRT1.8 proteins belong to major facilitator superfamily (MFS) and peptide transporter (PTR) with the conservative transmembrane domains and motifs (F-Y-L-A-L-N-L-G-S-L) in,, and. High-throughput transcriptome analysis showed that the expression ofgene was up-regulated and thewas down-regulated by low concentration nitrate treatment for 72 h in roots, which caused more nitrate transferred from roots to shoots. On the contrary, the ethylene/jasmonic acid-NRT signaling modulecould promoteup-regulation and inhibit the expression ofby cadmium treatment. So that more nitrate transported from shoots to roots and improved the ability of plants to resist cadmium stress. This study is valuable for the research of biological functions ofandfamily genes inand the responses to nitrate-cadmium stress. Our results also provide references for the bioinformatic study ofandfamily genes in other plant species.

; bioinformatics;;; nitrate; cadmium

2018-07-18;

2018-10-08;

2018-11-02.

10.3724/SP.J.1006.2019.84099

張振華, E-mail: zhzh1468@163.com

E-mail: ghliang1119@163.com

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目(2017YFD0200100, 2017YFD0200103)和國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(油菜)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資助。

This study was supported by the National Key R&D Program of China (2017YFD0200100, 2017YFD0200103) and the China Agriculture Research System.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.s.20181031.1457.002.html