通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇將耐儲(chǔ)藏主效QTL qSS-9Kas轉(zhuǎn)入寧粳4號(hào)提高其種子貯藏能力

張 平 姜一梅 曹鵬輝 張福鱗 伍洪銘 蔡夢(mèng)穎 劉世家 田云錄 江 玲,* 萬(wàn)建民,2

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通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇將耐儲(chǔ)藏主效QTLqSS-9轉(zhuǎn)入寧粳4號(hào)提高其種子貯藏能力

張 平1姜一梅1曹鵬輝1張福鱗1伍洪銘1蔡夢(mèng)穎1劉世家1田云錄1江 玲1,*萬(wàn)建民1,2

1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江中下游粳稻生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 江蘇省植物基因工程技術(shù)研究中心, 江蘇南京 210095;2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 / 農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程, 北京 100081

利用置換系SL36作為位點(diǎn)上Kasalath等位基因的供體親本, 各方面農(nóng)藝性狀較好的寧粳4號(hào)作為輪回親本, 通過(guò)回交和自交, 并使用4個(gè)與緊密連鎖的分子標(biāo)記Y-10、Y-11、Y-14、Y-13進(jìn)行基因型的檢測(cè)篩選, 對(duì)寧粳4號(hào)進(jìn)行耐貯性的遺傳改良, 獲得了既耐貯藏、大多農(nóng)藝性狀又接近于寧粳4號(hào)的較為穩(wěn)定的優(yōu)良新品系, 克服了寧粳4號(hào)耐貯藏性差的弱點(diǎn)。獲得的新品系種子在人工老化和自然老化條件下均表現(xiàn)出發(fā)芽率明顯提高、丙二醛含量顯著降低、TTC染色效果更明顯, 表明轉(zhuǎn)入耐儲(chǔ)藏主效QTL-9的寧粳4號(hào)新品系耐貯性顯著提高。

水稻; 置換系; 分子標(biāo)記輔助選擇; 耐貯性; 遺傳改良

水稻是我國(guó)最重要的糧食作物, 60%以上人口以稻米為主食。眾所周知, 稻谷在一般貯藏條件下第2年就會(huì)產(chǎn)生陳化變質(zhì)現(xiàn)象, 隨著貯藏過(guò)程中溫度和濕度的加大, 陳化過(guò)程也會(huì)加快。而具有良好耐貯藏特性的種子可以在同樣條件下保存更長(zhǎng)的時(shí)間, 并且在長(zhǎng)時(shí)間貯藏后, 仍會(huì)表現(xiàn)出較高的萌發(fā)與出苗能力和優(yōu)良的稻米品質(zhì), 可減少稻米陳化引起的損失[1]。種子耐貯性是一個(gè)受遺傳因素、種子發(fā)育成熟度和貯藏期間環(huán)境條件影響的復(fù)雜數(shù)量性狀, 與種子壽命和種子活力密切相關(guān)[2]。在同等貯藏條件下, 不同水稻品種的成熟種子在耐貯性上存在明顯差異, 如貯藏1年的武育粳3號(hào)的發(fā)芽率只有14%, 而耐貯的W017仍保持87.3%的發(fā)芽能力, 表明遺傳因素在種子耐貯性上有重要貢獻(xiàn)。

目前, 利用自然或人工老化處理方法, 已檢測(cè)到眾多的水稻種子耐貯性相關(guān)QTL, 除了第8和第10染色體外, 在其他染色體上均有相關(guān)QTL分布, 在第9染色體上存在一個(gè)在不同遺傳背景、不同生長(zhǎng)環(huán)境下均穩(wěn)定表達(dá)的主效QTL。Miura等[3]在Nipponbare/Kasalath//Nipponbare衍生的回交重組自交系(backcross inbred lines, BILs)群體中檢測(cè)到主效QTL, 即。Ren等[4]用Zhenshan 97/Minghui 63衍生的重組自交系群體(recombinant inbred lines, RILs)檢測(cè)到的與Miura等[3]檢測(cè)到的位置一致, 可能為同一個(gè)QTL。Xue等[5]在Asominori/IR24衍生的RIL群體中檢測(cè)到的與Miura等[3]報(bào)道的位點(diǎn)位置一致。Li等[6]利用Koshihikari/Kasalath//Koshihikari BIL群體在第9染色體檢測(cè)到主效QTL, 來(lái)自Kasalath的對(duì)耐貯性起增效作用。Lin等[7]用Nipponbare/ Kasalath//Nipponbare BIL群體檢測(cè)到3個(gè)QTL, 其中位于第9染色體上的對(duì)表型變異的貢獻(xiàn)率最大, 該結(jié)果與Miura等[3]檢測(cè)到的位點(diǎn)位置一致。這些結(jié)果說(shuō)明,、和可能是同一個(gè)控制種子耐貯性的穩(wěn)定的主效QTL。

本實(shí)驗(yàn)室Lin等[7]進(jìn)一步通過(guò)自然老化和人工老化兩種處理方法, 通過(guò)構(gòu)建次級(jí)F2分離群體和一系列近等基因系, 對(duì)來(lái)自耐貯性極強(qiáng)的秈稻品種Kasalath等位基因(簡(jiǎn)寫(xiě)為)的遺傳分析和精細(xì)定位, 將限定在146 kb之間, 獲得了與耐貯性緊密連鎖的分子標(biāo)記Y10、Y11、Y14和Y13。本研究即是在此基礎(chǔ)上, 利用這些緊密連鎖的分子標(biāo)記, 以寧粳4號(hào)為輪回親本, 以耐貯性的置換系SL36為供體, 進(jìn)行雜交和連續(xù)回交, 將轉(zhuǎn)育寧粳4號(hào), 創(chuàng)制攜帶耐貯的寧粳4號(hào)。

1 材料與方法

1.1 供試材料和主要農(nóng)藝性狀調(diào)查

“寧粳4號(hào)”是本實(shí)驗(yàn)室利用日本優(yōu)質(zhì)水稻品種“越光”和我國(guó)高產(chǎn)品種“鎮(zhèn)稻99”雜交選育而成, 表現(xiàn)出高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、綜合抗性較強(qiáng)、適應(yīng)性廣、生育期適中、米質(zhì)優(yōu)良等特點(diǎn)[8], 但其耐貯性較弱。為提高寧粳4號(hào)的耐貯性, 以寧粳4號(hào)為輪回親本, 以攜帶的日本晴(Nipponbare)為背景的染色體片段置換系SL36為供體(遺傳背景見(jiàn)圖1-A, 由日本農(nóng)業(yè)生物資源研究所提供), 進(jìn)行雜交和連續(xù)回交, 然后自交獲得BC5F2代。

如圖1-B, 2013年5月中旬將置換系SL36、寧粳4號(hào)種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土橋水稻試驗(yàn)站(南京市江寧區(qū)淳化街道土橋社區(qū)), 將寧粳4號(hào)與置換系SL36雜交獲得F1雜交種; 當(dāng)年冬季南繁獲得BC1F1代; 2014年5月中旬回交獲得BC2F1代雜交種; 冬季南繁獲得BC3F1代雜交種, 在2015年5月于土橋?qū)C3F1雜交收種后種植獲得BC3F2自交種, 下文命名為Y6647。

根據(jù)4個(gè)與緊密連鎖的分子標(biāo)記Y-10、Y-11、Y-14、Y-13[9](表1)對(duì)收取119份BC3F2群體進(jìn)行基因型的篩選, 將BC3F2在溫度40℃、濕度80%的人工氣候老化箱中處理25 d, 挑選種子活力顯著高于寧粳4號(hào)的10份進(jìn)行后代雜交繁育。2015年11月南繁選育獲得BC4F1雜交種; 2016年5月于土橋獲得BC4F2群體; 2016年11月南繁獲得BC5F1雜交種。2017年5月于土橋收獲BC5F2群體, 下文命名為Y3059, 均進(jìn)一步通過(guò)MAS和耐儲(chǔ)性鑒定, 選育出耐儲(chǔ)性較穩(wěn)定的品系, 成熟期調(diào)查株高、單株有效分蘗數(shù)、千粒質(zhì)量等農(nóng)藝性狀。

1.2 種子耐貯性表型鑒定

1.2.1 自然老化處理 參考Li等[6], 略作改動(dòng)。將同年正季在南京試驗(yàn)基地種植收獲的親本(置換系SL36、寧粳4號(hào))和119份BC3F2代種子在室溫<30℃、濕度40%~60%的環(huán)境中存放18個(gè)月。

1.2.2 人工老化處理 參照Z(yǔ)eng等[10], 略作修改。將同年正季在南京種植收獲的置換系SL36和寧粳4號(hào)在智能型種子老化試驗(yàn)箱(江蘇省南京研奧儀器設(shè)備有限公司, 型號(hào)為L(zhǎng)H-300S)中40℃和80%濕度的條件下分別處理20、25和30 d。根據(jù)同年親本預(yù)處理結(jié)果, 確定人工老化處理的時(shí)間。

1.2.3 發(fā)芽率測(cè)定 將人工老化處理后的種子發(fā)芽率作為種子耐貯性的間接評(píng)價(jià)指標(biāo)[3]。隨機(jī)選取50粒健康飽滿(mǎn)經(jīng)老化處理后的種子, 放入鋪有兩層濾紙的9 cm培養(yǎng)皿, 加8 mL水, 于30℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。以胚芽超過(guò)半粒種子長(zhǎng)和胚根超過(guò)種子長(zhǎng)度為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn), 統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率, 以發(fā)芽率的高低來(lái)判斷種子的耐貯性強(qiáng)弱。設(shè)2個(gè)重復(fù)。

圖1 染色體片段置換系SL36的基因型示意圖(A)和回交育種流程圖(B)

表1 本文中qSS-9的篩選標(biāo)記

1.3 TTC (2,3,5-氯化三苯基四氮唑)法測(cè)定種子生活力

參考Lopez[11]的方法。取50粒脫皮的種子在30℃水中浸泡48 h, 然后在含有0.5% (w/v) TTC (pH7.0)的PBS (磷酸鹽緩沖液)中黑暗染色2 h, 使用紅色的強(qiáng)度作為活力的量度。

通過(guò)改進(jìn)的測(cè)定法測(cè)量TTC還原含量[12]。TTC染色后, 將種子在濾紙上干燥并放入盛有10mL無(wú)水乙醇的15mL試管。在60℃水浴中浸泡6 h將種胚中紅色物質(zhì)提取出來(lái), 在室溫下以12,000 r min–1離心2 min, 測(cè)定上清液在分光光度計(jì)490 nm處OD值。在所有步驟中, 用未經(jīng)TTC染色的種子作空白對(duì)照。設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.4 生理生化指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 直鏈淀粉含量測(cè)定 按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB-7648-87法經(jīng)改進(jìn)簡(jiǎn)化, 稱(chēng)取過(guò)0.15 mm篩的待測(cè)精米粉樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品0.1000 g放入100 mL容量瓶, 加1 mL 95%乙醇和9 mL 1 mol L–1NaOH溶液, 沸水浴10 min后, 加蒸餾水定容至100 mL。吸取5 mL 樣品溶液至100 mL容量瓶中, 加1 mL 1 mol L–1乙酸溶液和1.5 mL碘液顯色并定容, 靜止20 min后在620 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值, 計(jì)算寧粳4號(hào)和置換系后代的直鏈淀粉含量。設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.4.2 MDA (丙二醛)含量測(cè)定 通過(guò)以下步驟從過(guò)完100目篩的糙米粉中提取MDA。取6粒左右健康飽滿(mǎn)的稻谷手工去殼后, 收集胚及糊粉層的混合物。在2.0 mL離心管中, 加入1 mL 0.05 mol L–1NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(pH 7.4), 在混合儀(Retsch MM301, 德國(guó))上以1/30 s的周期振蕩2 min后, 提取0.1 g糙米粉。測(cè)定采用MDA測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所), 以nmol mg–1表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 攜帶qSS-9Kas的染色體片段置換系具有強(qiáng)的耐貯性

室溫下貯藏18個(gè)月的寧粳4號(hào)的種子發(fā)芽率僅為26.70%±0.03%, 而置換系SL36和F1雜交種(SL36×寧粳4號(hào))的發(fā)芽率分別為91.10% ±0.05%和80.90% ±0.08%, 均與寧粳4號(hào)存在極顯著差異(< 0.01)(圖2-A, B), 表明位點(diǎn)上的Kasalath等位基因表現(xiàn)為強(qiáng)的耐貯性, 且為顯性效應(yīng)。TTC染色結(jié)果表明, 大部分寧粳4號(hào)種子的胚部均未染上紅色, 部分種子胚部雖已著色, 但著色程度較淺, 表明寧粳4號(hào)種子已基本喪失生活力。而置換系SL36和F1種子的種胚大多染上紅色且著色程度深, 表現(xiàn)出較強(qiáng)的種子生活力(圖2-C)。該結(jié)果與種子發(fā)芽測(cè)定結(jié)果一致, 說(shuō)明兩種方法均能檢測(cè)種子的耐貯性。

圖2 親本及F1種子在自然環(huán)境下貯藏18個(gè)月后的種子發(fā)芽率和TTC法測(cè)定的種子生活力

A: 親本及F1種子發(fā)芽率測(cè)定; B、C: 親本及F1發(fā)芽表現(xiàn)和TTC法種子生活力表現(xiàn), 從左到右依次是SL36、寧粳4號(hào)和F1。**表示與寧粳4號(hào)的發(fā)芽率相比, 在0.01水平上存在極顯著差異。

A: Germination rates of parents and F1; B,C: Seed germination and tetrazolium assay of parents SL36, Ningjing 4 and F1-(from left to right). ** means significant at the 0.01 probability level compared with the germination rate of Ningjing 4.

2.2 利用MAS方法, 將控制耐貯性的主效QTL qSS-9Kas導(dǎo)入寧粳4號(hào)

利用與緊密連鎖的分子標(biāo)記Y-10、Y-11、Y-14、Y-13對(duì)各親本進(jìn)行基因型分析。分子標(biāo)記電泳圖譜顯示寧粳4號(hào)與不耐貯的粳稻品種Nipponbare一樣, 在位點(diǎn)上不同于Kasalath的基因型, 即不攜帶qSS-9, 而置換系SL36則含有該QTL的Kasalath等位基因qSS-9(圖3-A)。在收取的200份置換系后代BC5F2的基因型鑒定和目的單株選育(圖3-B)中, 帶型和SL36一致的有194個(gè)。

共選擇212個(gè)均勻分布于12條染色體的多態(tài)性標(biāo)記對(duì)2017年正季BC5F2代單株進(jìn)行置換系背景鑒定, 發(fā)現(xiàn)BC5F2中寧粳4號(hào)遺傳背景達(dá)到約97.6%, 表明經(jīng)過(guò)高代回交,qSS-9已被成功轉(zhuǎn)育到寧粳4號(hào)中, 遺傳背景已較純合。

2.3 攜帶qSS-9Kas的寧粳4號(hào)改良系老化后丙二醛含量降低

種子中MDA的含量是衡量脂質(zhì)過(guò)氧化的主要指標(biāo), 隨著稻米貯藏時(shí)間的延長(zhǎng), 種子活性降低, MDA的含量不斷增加。自然老化處理一年后測(cè)定種子發(fā)現(xiàn), SL36、Y6647中MDA的含量(1.60~1.85 nmol mg–1)明顯低于對(duì)照寧粳4號(hào)(5.65 nmol mg–1)(圖4-A), 說(shuō)明與對(duì)照相比, 在常溫條件儲(chǔ)存下,攜帶qSS-9的置換系和改良系種子的劣變及衰老過(guò)程延緩, 脂質(zhì)降解產(chǎn)生的MDA較少。

圖3 各親本和BC5F2在與qSS-9緊密連鎖的分子標(biāo)記Y-10、Y-11、Y-14、Y-13下的基因型鑒定

A: 利用與緊密連鎖的分子標(biāo)記Y-10、Y-11、Y-14和Y-13對(duì)各親本的基因型進(jìn)行鑒定; 其中, 1:DNAmarker; 泳道2~5、6~9、10~13和14~17分別代表各品系在Y-10、Y-11、Y-14和Y-13的基因型; 泳道2、6、10和14為Nipponbare; 泳道3、7、11和15為寧粳4號(hào); 泳道4、8、12和16為置換系SL36; 泳道5、9、13和17為Kasalath。B: 利用與緊密連鎖的分子標(biāo)記Y-10、Y-11、Y-14和Y-13對(duì)寧粳4號(hào)、SL36及BC2F1間的基因型進(jìn)行鑒定: 其中1:DNA marker; 泳道2~6分別代表寧粳4號(hào)、SL36及BC2F1在Y-10下的基因型; 7~11分別代表寧粳4號(hào)、SL36及BC5F2在Y-11下的基因型; 12~16分別代表寧粳4號(hào)、SL36及BC2F1在Y-14下的基因型; 17~21分別代表寧粳4號(hào)、SL36及BC2F1在Y-13下的基因型。

A: Genotype identification of parents by molecular markers Y11 and Y14 close linkage to; 1:DNA marker; 2-5, 6-9, 10-13, and 14-17 indicate genotype of markers Y-10, Y-11, Y-14, and Y-13 respectively; 2, 6, 10, and 14 indicate genotype of Nipponbare; 3, 7, 11, and 15 indicate genotype of Ningjing 4; 4, 8, 12, and 16 indicate genotype of SL36; 5, 9, 13, and 17 indicate genotype of Kasalath, respectively. B: Genotype identification of Ningjing 4, SL36 and BC5F2by molecular markers Y11 and Y14 close linked to; 1:DNA marker; 2-6 : Genotype of Ningjing 4, SL36 and BC5F2under marker Y-10; 7-11: Genotype of Ningjing 4, SL36 and BC5F2under marker Y-11; 12-16: Genotype of Ningjing 4, SL36 and BC5F2under marker Y-14; 17-21: Genotype of Ningjing 4, SL36 and BC5F2under marker Y-13, respectively.

2.4 攜帶qSS-9Kas的寧粳4號(hào)改良系耐儲(chǔ)性顯著增強(qiáng)

自然條件儲(chǔ)存一年后, 寧粳4號(hào)的發(fā)芽率為78.0%±5.7%, 置換系SL36的發(fā)芽率為93.0%±1.4%, 置換系后代BC3F2發(fā)芽率為73.0%±12.7%, 但是繼續(xù)儲(chǔ)存一年后, 寧粳4號(hào)的發(fā)芽率降到20%以下,而置換系SL36的發(fā)芽率為77.0%±4.2%, BC3F2的發(fā)芽率仍保持在57.7%±8.4%, 活力相比寧粳4號(hào)顯著提高(圖4-B)。

2016年海南收獲的寧粳4號(hào)、置換系SL36和BC5F1代的破除休眠后種子在溫度40℃和濕度80%條件下老化35 d后, 寧粳4號(hào)的發(fā)芽率已降至69% ±1%, 而置換系SL36和BC5F1的發(fā)芽率仍分別保持在95%±2.5%和96.5%±3.0%, 表明qSS-9導(dǎo)入寧粳4號(hào)后, 顯著提高了其抗人工老化的能力(圖4-C)。

將2017年正季收獲的寧粳4號(hào)、置換系SL36和BC5F2代的種子破除休眠后, 人工老化處理30 d, 寧粳4號(hào)的發(fā)芽率為55.6%±1.7%, 而置換系SL36的發(fā)芽率為85.6%±2.6%, 兩者之間存在極顯著差異(0.01)。從194份含有目的片段的單株中挑選出發(fā)芽率較寧粳4號(hào)顯著提高的186份, 其中農(nóng)藝性狀與寧粳4號(hào)基本一致的3份種子發(fā)芽率分別為78%± 4%、91%±1%、76%±2%(圖4-D, E, F, G, H), 顯著高于寧粳4號(hào), 表明qSS-9導(dǎo)入寧粳4號(hào), 顯著提高其種子耐貯性。

2.5 攜帶qSS-9Kas的寧粳4號(hào)改良系種子活力增強(qiáng)

TTC在種子脫氫酶的作用下, 可還原產(chǎn)生TTCH (三苯甲簪), 以還原力的高低來(lái)判定種子的活力。TTC被還原越多, 產(chǎn)生紅色的TTCH就越多, 種子的活力越高, 用無(wú)水乙醇將不溶于水的TTCH從種胚中提取出來(lái), 測(cè)量提取液在TTCH最大吸收波長(zhǎng)490 nm處的吸光值, 以檢測(cè)種子的活力。取人工老化30 d的寧粳4號(hào)及攜帶qSS-9的寧粳4號(hào)改良家系種子, 進(jìn)行TTC染色, 如圖5-A所示, 改良系種子被染色的部分更多更深, 對(duì)TTCH含量測(cè)定發(fā)現(xiàn), 改良系種子中TTCH的含量是對(duì)照寧粳4號(hào)的1.5~2.0倍(圖5-B)。

2.6 攜帶qSS-9Kas的寧粳4號(hào)改良家系的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

由于稻米直鏈淀粉含量是決定品質(zhì)的最重要性狀之一, 其含量與米飯的黏性、柔軟性、光澤和食味品質(zhì)密切相關(guān)。為此, 我們測(cè)定了寧粳4號(hào)和Y3059-1-7、Y3059-1-8、Y3059-1-9老化處理前后直鏈淀粉的含量隨種子老化程度加深, 伴隨著種子發(fā)芽率的降低, 種子中直鏈淀粉的含量也有所降低(圖5-C), 但具體的變化機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

圖4 親本和后代種子在不同老化處理下的發(fā)芽率和丙二醛的含量

A: 寧粳4號(hào)、SL36、BC3F2(Y6647)在自然老化一年MDA含量; B: 寧粳4號(hào)、SL36、BC3F2在自然老化一年和兩年的發(fā)芽率; C: 親本和BC5F1種子在人工老化處理35 d后的發(fā)芽率; D: 寧粳4號(hào)、Y3059-1-7、Y3059-1-8、Y3059-1-9的發(fā)芽率; E~H: 老化處理30 d后的發(fā)芽情況。E、F、G、H分別代表寧粳4號(hào)、Y3059-1-7、Y3059-1-8、Y3059-1-9。*表示在= 0.05水平上差異顯著; **表示在= 0.01水平上差異極顯著。

A: Contents of MDA in seeds of Ningjing 4, SL36, and BC3F2after natural aging for one year; B: Germination rate of Ningjing 4, SL36 and BC3F2after natural aging forone year and two years; C: Germination rates of parents and BC5F1after artificial aging for 35 days; D: Seed germination of BC5F2and Ningjing 4 after accelerated aging for 30 d and storage at 40°C and 80% RH; E-H: Seed viability of the control after aging treatment; E, F, G, and H represent Ningjing 4, Y3059-1-7, Y3059-1-8, Y3059-1-9, respectively. Significant differences relative to the control were assessed by-tests. * and **, significant at= 0.05 and= 0.01, respectively. Values are means ± SD (= 2).

圖5 寧粳4號(hào)和Y3059的TTC試驗(yàn)、直鏈淀粉含量和株型的比較

A: 老化處理30 d后寧粳4號(hào)和Y3059的TTC染色情況, 從左到右分別代表寧粳4號(hào)、Y3059-1-7、Y3059-1-8、Y3059-1-9; B: Y3059及寧粳4號(hào)種子中TTCH的含量; C: 寧粳4號(hào)和Y3059老化處理前后表觀淀粉含量的變化; D: 抽穗時(shí)期寧粳4號(hào)(左)和BC5F2(右)株型; E: 抽穗35 d后寧粳4號(hào)(左)和BC5F2(右)株型。*表示在= 0.05水平上差異顯著;**表示在= 0.01水平上差異極顯著。

A: Tetrazolium assay of Ningjing 4 and Y3059; From left to right represent Ningjing 4, Y3059-1-7, Y3059-1-8, Y3059-1-9, respectively; B: The content of TTCH of Y3059and Ningjing 4; C: The change of apparent amylose content in Ningjing 4 and Y3059;D: Plant type of Ningjing 4 and BC5F2at heading;E: Plant type of Ningjing 4 and BC5F2at 35 days after heading; Significant differences relative to the control were assessed by-tests. * and **, significant at= 0.05 and= 0.01, respectively. Values are means ± SD (= 2).

對(duì)改良家系進(jìn)行農(nóng)藝性狀考察, 如圖5-D, E所示, 改良系和寧粳4號(hào)的抽穗期、結(jié)實(shí)率、千粒重、單株產(chǎn)量都沒(méi)有顯著差異(表2)。表明在提高寧粳4號(hào)耐貯性的同時(shí)并沒(méi)有影響其主要的農(nóng)藝性狀。

表2 寧粳4號(hào)和Y3059農(nóng)藝性狀的比較

*表示在= 0.05水平上差異顯著;**表示在= 0.01水平上差異顯著。

*and**, significant at= 0.05 and= 0.01, respectively. HD: heading date; PH: plant height;NT: number of tillers;SSR: seed setting rate; TGW: 1000-grain weight; YPP: yield per plant.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)室Li等[6]利用Koshihikari/Kasalath// Koshihikari BIL群體在南京、連云港、金湖3個(gè)不同地方種植并進(jìn)行種子耐貯性相關(guān)QTL分析, 在第9染色體標(biāo)記R10783S和R1751區(qū)間檢測(cè)到qSS-9, 并且利用CSSL群體驗(yàn)證了qSS-9的真實(shí)性。該位點(diǎn)與Miura等[3]檢測(cè)到的位置一致, 在此基礎(chǔ)上, 林秋云[9]利用以Nipponabre為背景, Kasalath為置換片段的染色體片段置換系SL36與Nipponabre回交, 構(gòu)建次級(jí)F2分離群體, 對(duì)qSS-9進(jìn)行遺傳分析, 同時(shí)進(jìn)行F3后代驗(yàn)證和構(gòu)建的近等基因系進(jìn)行驗(yàn)證, 獲得了與qSS-9緊密連鎖的Indel標(biāo)記Y11和Y14, 在Nipponbare基因組上的物理距離約為147 kb。同時(shí)用以Koshihikari為背景, Kasalath為置換片段的染色體片段置換系SL226與Koshihikari回交, 構(gòu)建次級(jí)F2分離群體, 對(duì)qSS-9進(jìn)行精細(xì)定位, 將qSS-9定位在Indel標(biāo)記Y7和Y13之間, 在Nipponbare基因組上的物理距離約為478 kb。兩種qSS-9的精細(xì)定位區(qū)間重疊。經(jīng)過(guò)多年多點(diǎn)的檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)qSS-9是真實(shí)存在并穩(wěn)定表達(dá)的主效QTL。本研究在前期定位基礎(chǔ)上, 利用4個(gè)Indel標(biāo)記Y10、Y11、Y14和Y13, 對(duì)本實(shí)驗(yàn)室選育的主栽粳稻品種寧粳4號(hào)與耐貯性的染色體片段置換系SL36的回交和自交后代單株, 進(jìn)行分子標(biāo)記的選擇, 再經(jīng)過(guò)老化后種子活力檢測(cè)及目標(biāo)性狀的選育, 已將qSS-9轉(zhuǎn)育到寧粳4號(hào)中, 獲得耐貯性的寧粳4號(hào)。

影響種子耐貯性的因素很多, 如種子自身的遺傳因素、種子灌漿成熟時(shí)的氣候條件、收獲干燥條件、種子貯藏時(shí)的外界環(huán)境等。本研究發(fā)現(xiàn)在同一型號(hào)的同一臺(tái)老化箱中, 每次老化的時(shí)間均有一定的波動(dòng), 如南繁收獲的種子, 可能由于海南熱帶季風(fēng)氣候, 種子灌漿時(shí)期溫度較高, 收獲時(shí)較為干燥, 種子的生長(zhǎng)狀況良好, 耐貯性稍強(qiáng), 人工老化時(shí)間也會(huì)相應(yīng)增加, 說(shuō)明水稻自身的狀況對(duì)種子耐貯性有一定的影響。本研究中雖然不同年份不同批次的老化試驗(yàn)結(jié)果略有差異, 但總體趨勢(shì)是一致的, 轉(zhuǎn)育了qSS-9的寧粳4號(hào), 其耐貯性均明顯高于背景親本寧粳4號(hào)。同時(shí), 本文使用了兩種不同的老化方法, 在短時(shí)間內(nèi)用自然老化方法較難評(píng)價(jià)種子的耐貯性[13]; 人工老化是在人為控制的環(huán)境條件下加快種子老化速率, 高溫高濕是目前最常用的人工老化方法[14]。通過(guò)人工老化處理后種子在短時(shí)間內(nèi)發(fā)芽率下降明顯, 因此可以快速評(píng)價(jià)種子的耐貯性, 彌補(bǔ)自然老化所需較長(zhǎng)時(shí)間的缺點(diǎn)。Rajjou等[15]認(rèn)為人工加速老化可以模擬自然老化從而提高鑒定種子耐貯性的效率。許惠濱等[16]認(rèn)為短時(shí)間的高溫高濕加速老化條件不能完全替代自然老化。從本文的研究結(jié)果看, 人工老化雖然與自然老化結(jié)果有一定的差異, 但兩種方法均可驗(yàn)證, 在通過(guò)不斷回交轉(zhuǎn)育的后代中, 種子的耐貯性的確得到提高, 因此, 人工老化同樣可適用于分子標(biāo)記輔助育種。我們已成功地將耐儲(chǔ)藏主效QTLqSS-9引入到主栽品種寧粳4號(hào)中。

生產(chǎn)上, 人們一般通過(guò)改善貯藏條件, 如修建氣調(diào)庫(kù)或低溫庫(kù)、選擇合適的包裝材料和微波處理種子等[17], 雖然可以延緩稻米貯藏期間的陳化, 但需要消耗大量的人力和財(cái)力。從遺傳角度改良種子本身的耐貯性, 能更加經(jīng)濟(jì)、有效地解決種子在貯藏過(guò)程中的陳化變質(zhì)問(wèn)題。因此, 水稻種子耐貯性的分子育種已經(jīng)成為水稻育種的重要目標(biāo)之一。本研究采用人工老化為主, 自然老化為輔, 結(jié)合MAS方法, 將來(lái)源于Kasalath的控制種子耐貯性的主效QTLqSS-9轉(zhuǎn)移到寧粳4號(hào)中, 從種子自身的遺傳基因來(lái)提高種子的耐貯性, 經(jīng)過(guò)多年多種方法驗(yàn)證, 表明該手段能穩(wěn)定有效提高其種子的耐貯性。如自然條件下貯藏2年的種子, 寧粳4號(hào)的發(fā)芽率已低于20%, 而改良家系Y6647的發(fā)芽率仍保持在57.7% ±8.4%。為耐貯性分子育種奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)將來(lái)源于Kasalath的控制種子耐貯性的主效QTLqSS-9轉(zhuǎn)育到主栽品種寧粳4號(hào)中, 獲得的寧粳4號(hào)改良系表現(xiàn)出更高的耐貯性, 同時(shí)大多數(shù)農(nóng)藝性狀和寧粳4號(hào)無(wú)顯著差異。

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Introducinginto Ningjing 4 by molecular marker-assisted selection to improve its seed storage ability

ZHANG Ping1, JIANG Yi-Mei1, CAO Peng-Hui1, ZHANG Fu-Lin1, WU Hong-Ming1, CAI Meng-Ying1, LIU Shi-Jia1, TIAN Yun-Lu1, JIANG Ling1,*, and WAN Jian-Min1,2

1State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement / Key Laboratory of Biology, Genetics and Breeding of Japonica Rice in Mid-lower Yangtze River, Ministry of Agriculture / Research Center of Jiangsu Plant Gene Engineering, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China;2National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

In this paper, the chromosome segment substitution line SL36 was used as the donor parent with the Kasalath allele at thelocus. Ningjing 4, a commercial cultivar with ideal agronomic traits, was used as a recurrent parent, through continuous self-pollination and backcrossing for four consecutive years. Four molecular markers Y-10, Y-11, Y-14, Y-13 closely linked towere used to screen genotypes, and molecular marker-assisted selection (MAS) was used for seed storage ability breeding for Ningjing 4. Through genetic improvement, we obtained inheritable lines with high seed storage ability. Most agronomic traits of the lines were nearly the same as those of Ningjing 4. These lines showed significantly higher germination rate, lower malondialdehyde content and more obvious TTC staining effects under artificial aging and natural aging conditions compared with Ningjing 4, indicating that the new lines withhave high seed storage ability.

rice; chromosome segment substitution line; molecular marker-assisted selection; seed storage ability; genetic improvement

2018-07-06;

2018-12-24;

2019-01-03.

10.3724/SP.J.1006.2019.82035

江玲, E-mail: jiangling@njau.edu.cn

E-mail: 2016101096@njau.edu.cn

本研究由國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專(zhuān)項(xiàng)(2016ZX08001006), 江蘇省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目(BE2018388, BE2017368)和江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目資助。

This study was supported by the National Major Project for Developing New GM Crops (2016ZX08001006), the Key Science and Technology Project of Jiangsu Province (BE2018388, BE2017368), and Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Crop Production.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20181229.1351.002.html