骨髓間充質(zhì)干細胞修飾治療急性肝功能衰竭的研究進展

陳笑艷，王經(jīng)琳，施曉雷

（1.東南大學(xué)醫(yī)院 外科，江蘇 南京 210018；2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 肝膽外科，江蘇 南京210008）

我國是肝病高發(fā)國家，各種肝病引起的急、慢性肝功能衰竭患者病情兇險、進展迅速、預(yù)后較差，內(nèi)科藥物治療病死率高達50%～80%[1]。急性肝功能衰竭（acute liver failure，ALF）是由多種病因?qū)е碌耐话l(fā)、嚴重的肝損傷，伴有大量肝細胞功能障礙，可表現(xiàn)為嚴重的肝性腦病、凝血功能障礙、黃疸和進行性多器官功能衰竭。因此，ALF的治療一直是臨床上亟待解決的難題。肝移植是治療ALF最確切的手段，但臨床應(yīng)用受到了供體短缺、手術(shù)費用高昂、術(shù)后需要長期服用免疫抑制劑等原因的限制，臨床上僅有很少一部分患者實施肝移植治療。干細胞移植近年來發(fā)展迅速，因其移植簡單，對受體的影響小，價格相對較低，成為繼肝移植后又一治療ALF的有效手段[2]。目前，細胞移植治療ALF的種子細胞包括肝細胞、造血干細胞、間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、誘導(dǎo)多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSs）等[3-4]。MSCs因其來源豐富、增殖能力強、沒有倫理制約，是細胞移植中最理想的細胞來源[5]。因此，MSCs移植治療ALF成為研究的熱點[6]。MSCs通過免疫調(diào)節(jié)可以促血管生成[7]、抗凋亡[8]和抗氧化[9]。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs在肝衰竭、肝纖維化、肝硬化等肝臟疾病的治療具有良好的效果[10]。

雖然干細胞療法已經(jīng)取得了一定的進展，但針對這些臨床研究的系統(tǒng)評價發(fā)現(xiàn)：目前已有的干細胞移植僅能改善患者部分肝功能指標，并且對于患者的生存期并無顯著影響[11]。在MSCs移植過程中，由于移植干細胞對損傷部位的嚴重氧化和炎癥應(yīng)激的抵抗力不足造成只有少數(shù)細胞可以遷移到受損組織，移植后低細胞存活率顯著降低了其治療效果[12]。盡管目前MSCs的優(yōu)勢使其在再生領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，但如何將足夠量的MSCs有效的遞送到受損組織，這一過程仍存在相當(dāng)多的挑戰(zhàn)，限制了MSCs真正的臨床應(yīng)用，阻礙了MSCs移植治療從實驗室進入臨床研究。

1 MSCs的治療缺點

MSCs存在于體內(nèi)低氧張力（即1%～5% O2）的微環(huán)境中，而一般培養(yǎng)環(huán)境（即20%～21% O2）的氧濃度，高于其原始生存環(huán)境[13-14]，因此，一旦將MSCs從原始組織中分離出來并誘導(dǎo)其在體外增殖，周圍環(huán)境不足以維持其自我更新和分化的能力。隨著周圍微環(huán)境的改變，MSCs在分離和體外培養(yǎng)后將失去一部分功能。不僅如此，在各種疾病的病理狀態(tài)下，MSCs自我更新和分化的能力降低，這限制了細胞資源的基本應(yīng)用。體內(nèi)移植后，特殊的病理環(huán)境顯著降低了MSCs的自我更新能力和存活率。因此，盡管培養(yǎng)的MSCs被廣泛應(yīng)用于細胞移植，但低存活率和高凋亡率降低了其治療效果。因此，如何增加細胞定向遷移的數(shù)量是干細胞移植的關(guān)鍵因素[15]。

針對這一問題，研究發(fā)現(xiàn)在其應(yīng)用前對缺氧、藥理學(xué)、化學(xué)制劑、營養(yǎng)因子、細胞因子和物理因子進行預(yù)處理能夠激活生存信號，以對抗MSCs移植應(yīng)用的微環(huán)境。最近研究表明，經(jīng)過預(yù)處理的MSCs能顯著提高細胞存活率，增加分化效果，促進旁分泌作用，提高損傷部位的修復(fù)能力[16-18]。預(yù)處理、基因修飾和MSCs培養(yǎng)條件的優(yōu)化是提高MSCs在體內(nèi)定值能力和體內(nèi)發(fā)揮功能的關(guān)鍵，有助于提高組織工程和再生醫(yī)學(xué)的MSC移植效果[16]。對MSCs進行預(yù)處理，基因修飾或使用生物材料包被后的移植為提高MSCs的存活率，促進其神經(jīng)源性、血管生成性和免疫調(diào)節(jié)特性開辟了新的途徑。Tang等[19]發(fā)現(xiàn)MSCs與褪黑素、Liu等[20]發(fā)現(xiàn)血管緊張素II、Li等[21]發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀的預(yù)處理技術(shù)分別顯示增強了腦缺血和心肌梗死的干細胞治療。因此，研究更有效的途徑來改善MSCs對ALF治療效果是非常必要的。

2 MS C s的預(yù)處理

MSCs預(yù)處理的主要方法有：使用生物材料包被后移植、缺氧預(yù)處理、使用細胞因子預(yù)處理干細胞以提高其對惡劣環(huán)境的耐受性、改善干細胞移植區(qū)域的微環(huán)境和選用適當(dāng)?shù)幕驅(qū)Ω杉毎M行修飾等。

2.1 使用生物材料包被

2.1.1 膠原凝膠復(fù)合MSCs：采用膠原凝膠復(fù)合間充質(zhì)干細胞治療肝功能衰竭患者。膠原凝膠是水凝膠的一種，具有水凝膠的特性，可以形成立體三維網(wǎng)狀支架，同時膠原蛋白作為天然的細胞外基質(zhì)，它具有無毒、低免疫原性和可降解性的優(yōu)點[4，11，15]。膠原是一種天然來源的高分子蛋白質(zhì)，具有來源方便、體內(nèi)可降解和低免疫原性等優(yōu)勢。膠原蛋白作為細胞外基質(zhì)的主要成份，具有良好的生物相容性，被認為是理想的生物材料。它不僅為細胞的靶向遞送提供載體，同時又為細胞粘附和組織三維重建提供支架作用，因此，可以提高移植細胞的運輸效率，并且可以在體內(nèi)提供移植細胞的生存空間，進而可以改善被移植細胞的存活率，并有助于在一定程度上解決單純的干細胞移植所存在的滯留率和存活率低而限制了治療效果的問題[22]。用生物材料承載干細胞可提升干細胞的治療效應(yīng)已得到廣泛確認[23-24]。

2.1.2 細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）：ECM是由動物細胞合成并在細胞外分泌的大分子，其分布在細胞表面或細胞之間，主要是多糖和蛋白質(zhì)，或蛋白多糖。這些物質(zhì)構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，支持和連接組織結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)組織發(fā)育和細胞生理活動。ECM是微環(huán)境的重要組成部分，為維持細胞功能提供重要的生化與物理信號。該研究模擬了使用細胞外基質(zhì)系統(tǒng)在體外培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞所需的三維微環(huán)境[25-26]，通過這種方式，獲得具有臨床級數(shù)量和“干性”維持能力的間充質(zhì)干細胞。

2.1.3 GFc7：這是一種納米螯合基納米復(fù)合材料，它可以促進細胞增殖，表達多能性基因和自導(dǎo)標記和抗氧化防御；自發(fā)的分化相關(guān)基因被抑制，而決定細胞命運的特定的分化相關(guān)基因的方向顯著上調(diào)[27]，進而能夠提高MSCs的移植治療效果。

2.2 缺氧預(yù)處理

O2對于細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，因為缺氧是一些高發(fā)病率和高死亡率疾病的主要發(fā)病機制[28]。在缺氧條件下的預(yù)處理MSCs，如H2O2（氧化應(yīng)激）和特殊細胞因子預(yù)處理是近年來提高MSCs生存率和潛能的常用策略[29]。對MSCs進行缺氧預(yù)處理包括先2.5% O2培養(yǎng)15 min，21% O2再氧化30 min，72 h的缺氧預(yù)處理可以顯著提高MSCs在體外增殖和遷移的能力[30]，缺氧會降低MSCs的細胞活性和增殖，但復(fù)氧的這一過程會促進MSCs的恢復(fù)，進而提高其細胞活性。研究者證實缺氧和復(fù)氧還能夠促進體外培養(yǎng)的MSCs的多效性[30-31]。缺氧預(yù)處理可以提高遺傳穩(wěn)定性和染色體穩(wěn)定性，并確保MSCs在體外的安全性[32]。有證據(jù)表明，缺氧預(yù)處理MSCs的移植可以通過上調(diào)細胞因子和生長因子的分泌來增強治療效果[33-34]。考慮到缺氧和復(fù)氧的優(yōu)點，目前的研究主要集中在優(yōu)化氧濃度，從而改善MSCs的細胞活性和治療效果。雖然研究證實缺氧是MSCs在體外和體內(nèi)的保護性因素，但仍有必要確定最佳氧濃度，以提高MSCs的存活率和治療效果。

2.3 使用細胞因子對干細胞進行預(yù)處理

2.3.1 pHGF與MSCs聯(lián)合治療：促肝細胞生長素（promoting hepatocyte growth factor，pHGF）是從乳豬新鮮肝臟中提取純化的一種小分子多肽類活性物質(zhì)，一定濃度的pHGF可以提高細胞抗氧化的能力，從而達到抑制細胞凋亡和壞死的作用。其對穩(wěn)定受損肝組織的環(huán)境，保護肝細胞，加速肝臟修復(fù)有一定的作用。pHGF對CCL4誘導(dǎo)的肝細胞損傷有良好的保護作用。該研究發(fā)現(xiàn)，pHGF與MSCs的組合可以更有效地下調(diào)ALF大鼠的全身炎癥反應(yīng)，從而減輕肝損傷，改善肝壞死，降低轉(zhuǎn)氨酶水平[35]。總而言之，pHGF與MSCs在ALF大鼠模型治療中的組合優(yōu)于單獨使用MSCs或pHGF，這可能與pHGF誘導(dǎo)的ALF大鼠模型肝臟中MSCs細胞數(shù)增加有關(guān)。

2.3.2 ZD和穩(wěn)定的miR-210為基礎(chǔ)進行預(yù)處理：miR-210的精確調(diào)控對于ALF的細胞穩(wěn)態(tài)維持和移植效能的增強至關(guān)重要。在目前的研究中，我們證明了一種小分子zeaxanthin dipalmitate（ZD）可以增強人體脂肪源間充質(zhì)干細胞（hAD-MSCs）在體外的抗應(yīng)激能力，并提高其在體內(nèi)移植后治療ALF的效果[36]。ZD處理顯著促進細胞存活并通過PKC/raf1/MAPK/NF-kappa B通路，抑制細胞凋亡、炎癥和活性氧（ROS）的產(chǎn)生，維持了miR-210的高表達水平。基于ZD和穩(wěn)定的miR-210的預(yù)處理，顯著提高了干細胞移植的療效，提高其抗氧化水平，并顯著提高了移植治療后肝臟組織的修復(fù)能力。維持miR-210的生理水平對hAD-MSC的體內(nèi)平衡至關(guān)重要[36]。

2.4 改善干細胞移植區(qū)的微環(huán)境

基于干細胞治療的臨床應(yīng)用的主要問題之一是由于損傷組織的氧化應(yīng)激和炎癥環(huán)境導(dǎo)致的低細胞存活率。迄今為止，包括NAC、edaravone和褪黑素在內(nèi)的幾種抗氧化劑，通過增強抵抗氧化應(yīng)激、炎癥、凋亡和其他應(yīng)激源[37-39]的內(nèi)源性防御能力，可以安全增強移植效果。

2.5 使用適當(dāng)?shù)幕蛐揎椄杉毎?/h3>

MSCs不僅易于被基因載體所轉(zhuǎn)染或感染，亦能穩(wěn)定高效地表達特定的外源目的基因，因此MSCs是用于在基因治療期間攜帶治療基因的種子細胞的理想選擇[40]，轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以提高MSCs在體內(nèi)的功效，它可以通過分泌因子減少其在缺氧和炎癥環(huán)境中的細胞凋亡，并增加其對受損組織的定植率和分化成特定組織的能力。

Zheng等[41]將白細胞介素-1受體拮抗劑（IL-1Ra，具有抗炎和抗凋亡作用）轉(zhuǎn)染到MSCs中，將高表達IL-1Ra的MSC移植入ALF大鼠后，與其他組相比，肝損傷、炎癥因子（IL-1β、IL-6）和死亡率顯著下降，并且MSCs在肝臟的定植率顯著上升。Xiao等[42]使用殼聚糖納米粒和IL-1Ra制備緩釋結(jié)構(gòu)，通過與MSCs共同移植到ALF豬中，肝細胞增殖水平和肝功能得到顯著改善。Ma等[43]發(fā)現(xiàn)MSCs移植對ALF的定植率較低，而CXCR4轉(zhuǎn)染的MSCs的定植率顯著增加，促進了肝細胞的增殖和功能恢復(fù)。

2.6 化學(xué)修飾

由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)影響MSCs的特征，因此在細胞移植之前用藥物預(yù)處理MSCs，它可以提高MSCs在炎癥環(huán)境中的存活率和修復(fù)受損組織的能力。

2.6.1 自噬調(diào)節(jié)的MSCs：研究人員已經(jīng)推出了一種新的策略，以增強基于MSCs的肝臟疾病，特別是ALF的細胞療法。在短時間內(nèi)，自噬調(diào)節(jié)的MSCs更有可能通過旁分泌的作用促進肝再生。進一步的研究，包括在MSCs擴展過程中對ATG7表達的評價，它對移植后的動物模型中MSCs的存活和追蹤產(chǎn)生影響。MSCs的自噬抑制可以改善其肝再生潛能，并可作為改善ALF細胞治療的新策略[44]。

2.6.2 氟西汀預(yù)處理的MSCs：氟西汀增強MSCs的存活和它們對MSCs的旁分泌特性。此外，氟西汀預(yù)處理的MSC組顯示了神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derive neurotrophic factor，BDNF）和血管生成因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA的表達顯著升高改善了MSCs旁分泌的特性[45]。氟西汀對MSCs的預(yù)處理提高了它們的生存、旁分泌和免疫調(diào)節(jié)特性，并直接影響了神經(jīng)組織形態(tài)學(xué)。

2.6.3 中草藥對MSCs的保護：研究發(fā)現(xiàn)某些中藥可以用于保護MSCs，使其免受傷害，并增加MSCs在體外的分化含量。黃芪甲苷可以抵抗氧化性鏈球菌的損傷，通過降低NF-kB p65的易位，以及增加MMP-2表達[46]，能夠促進MSCs增殖，并抑制MSCs中Toll樣受體4 （Toll-like receptor 4，TLR4）的高糖誘導(dǎo)表達。

2.7 骨髓聯(lián)合移植

1978年Schofield[47]首先提出了龕（niche）的概念，造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）固定于微環(huán)境中。隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)，骨髓微環(huán)境是一個三維結(jié)構(gòu)環(huán)境，是體內(nèi)容納干細胞生存并調(diào)控其自我更新、分化發(fā)育、歸巢定位的細胞微環(huán)境，它主要包括基質(zhì)細胞、細胞外基質(zhì)和各種細胞因子。HSCs和MSCs是存在于其中的兩類干細胞。Urban等[48]在1型糖尿病的動物模型中將MSCs和骨髓細胞（bone marrow cells，BMCs）共同移植到糖尿病小鼠體內(nèi)時發(fā)現(xiàn)血糖及胰島素水平可以恢復(fù)到正常水平，但是單一移植則沒能夠達到相同的效果。MSCs和BMCs協(xié)同誘導(dǎo)受體來源的胰腺胰島素分泌細胞再生。其次，MSCs可以抑制T細胞介導(dǎo)的針對新生細胞的免疫反應(yīng)。Moioli等[49]也發(fā)現(xiàn)在骨損傷后的血管形成過程中，聯(lián)合移植MSCs和HSCs，血管數(shù)量和直徑較單獨移植MSCs時顯著增加，聯(lián)合移植促進組織血管化和再生。在骨組織、肌肉組織及真皮組織等依賴血管形成的損傷修復(fù)及內(nèi)臟組織再生中，HSCs有協(xié)同MSCs的作用。MSCs與其周圍的微環(huán)境一起移植到肝臟，在肝臟的新的微環(huán)境中，骨髓間充質(zhì)干細胞可能會發(fā)揮更好的修復(fù)損傷肝組織的作用，為臨床治療ALF提供新的思路和方法。

3 結(jié)語

MSCs已被證明可以保護組織和器官免受外部傷害，然而研究發(fā)現(xiàn)，MSCs一旦離開原始組織并在體外誘導(dǎo)增殖，周圍微環(huán)境的變化就不足以維持其分化和自我更新。隨著微環(huán)境的改變，會導(dǎo)致體外培養(yǎng)的MSCs喪失部分生物學(xué)功能。此外，在移植過程中，只有少數(shù)細胞能夠遷移到受損的組織中，移植后的低細胞存活率顯著降低了其治療效果。因此，盡管近年來MSCs細胞移植得到迅速發(fā)展，但是仍然有相當(dāng)多的挑戰(zhàn)限制了MSCs真正的臨床應(yīng)用，仍有必要研究更有效的途徑來改善其治療效果。MSC修飾或MSCs與其他治療方法的結(jié)合也越來越受到重視，培養(yǎng)條件的預(yù)處理、遺傳修飾和優(yōu)化是提高MSCs體外和體內(nèi)功能的關(guān)鍵策略，所有這些步驟都有助于提高MSCs移植在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中的效能，但是還應(yīng)該對MSCs修飾的具體機制進行更多的研究，進一步闡明相關(guān)修飾是如何影響移植到體內(nèi)的MSCs的生物學(xué)活性，進而使得MSCs的治療可以得到更廣泛的應(yīng)用，并從實驗室研究中推動MSCs移植進入臨床研究階段。