長鏈非編碼RNA在特發性肺纖維化中的研究進展

楊赟 邱慧 周軍

蘇州大學附屬第三醫院 常州市第一人民醫院呼吸內科213000

特發性肺纖維化 (idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種慢性進行性纖維化性間質性肺炎，病變局限于肺部，主要發生于老年男性，IPF的病理生理特征包括肺泡上皮損傷、炎細胞浸潤、成纖維細胞過度增殖以及細胞外基質沉積。IPF的臨床表現為進行性加重的呼吸困難，伴限制性通氣功能障礙和氣體交換障礙，導致低氧血癥甚至呼吸衰竭。纖維化反應包含4個主要階段：第一階段是由器官的原發性損傷驅動纖維化反應的開始；第二階段是效應細胞的活化；第三階段是細胞外基質的加工；第四階段是肺纖維化階段。后3個階段相互重疊，促進細胞外基質的動態沉積 (和不充分的再吸收)，促進纖維化進展，最終導致終末器官衰竭[1]。

1 IPF的發病機制

IPF可能是由環境暴露 (包括香煙煙霧)和遺傳易感性之間的相互作用引起的[2]。研究表明，表觀遺傳機制在IPF的發生、發展中發揮重要作用。表觀遺傳修飾包括DNA甲基化、非編碼RNA和組蛋白修飾。在一項包含94例IPF患者和67名對照者的DNA甲基化大型臨床研究中，研究者發現IPF的DNA甲基化與結腸癌相似，甲基化不同的區域大都分布在CpG島附近[3]。這種異常的甲基化模式加速IPF患者表觀基因組的老化，使得IPF患者的人端粒逆轉錄酶和人端粒酶m RNA表達降低，端粒縮短，端粒酶的功能異常[4]。IPF患者肌成纖維細胞Fas啟動子沉默，組蛋白去乙酰化減少。相反，阻止組蛋白去乙酰化可以促進成纖維化細胞凋亡，恢復纖維化抑制基因Thy-1的表達，減輕肺纖維化[5]。除遺傳因素以外，肺泡上皮細胞的反復損傷、上皮-間質轉化 (epithelial-mesenchymal transition，EMT)[6]、凝血功能、先天性和適應性免疫等也參與了IPF的發生、發展[2]。

2 長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)概述

人基因組上有30億個堿基對，其中1.5%可以編碼蛋白質，98.5%為非蛋白質編碼基因[7]。大量非編碼RNA的研究提示這些不翻譯成為蛋白質的RNA分子參與或主導了極其復雜的調控，可能有著比翻譯成蛋白質的小部分RNA更重要的地位[8]。非編碼RNA包括短鏈非編碼RNA[如微小RNA(microRNA，miRNA)]和lncRNA。

miRNA是一類長度約為22個核苷酸的非編碼小RNA，已發現miRNA參與細胞增殖、分化和凋亡[9]。目前研究已證實包括let-7d、miR-200、miR-26a和miR-375在內的許多miRNA參與IPF[10-13]。miRNA參與IPF的機制多種多樣，miRNA可以通過調節肺損傷的早期炎癥[14]、調節肺成纖維細胞的功能、調節DNA甲基化和組蛋白甲基化、抑制膠原沉積等參與IPF[9]。此外，miRNA可充當IPF早期診斷的生物標志物以及作為IPF的治療靶點。與miRNA一樣，非編碼RNA的失調也參與IPF的發生、發展。

lncRNA是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，根據基因位置可分為外顯子重疊lncRNA、內含子重疊lncRNA、內含子反義lncRNA、天然反義lncRNA、雙向lncRNA、基因間lncRNA 6種。lncRNA雖然不能編碼蛋白質，卻在表觀遺傳、轉錄、轉錄后和翻譯水平具有重要調節作用，廣泛參與許多重要的生物過程，如基因印記、細胞增殖和分化、免疫反應和染色體結構等，從而得到了研究界的廣泛關注。近年來，越來越多的研究報道證實lncRNA參與調控IPF的發病過程。

3 IPF中異常表達的lncRNA

3.1 lncRNA AJ005396和S69206 2013年，Cao等[15]在博來霉素誘導的肺纖維化大鼠模型中發現568個差異表達的lncRNA，其中210個上調，358個下調。利用原位雜交的方法發現在肺纖維化大鼠的肺間質細胞的胞質中lncRNA AJ005396和S69206表達增加。UCSC數據庫顯示，AJ005396和S69206序列分別與COL11A1和RMCP-1重疊。在肺纖維化大鼠中，lnc RNA AJ005396和S69206上調，但是COL11A1和RMCP-1的表達沒有顯著差異。該實驗首次發現了lncRNA在肺纖維化大鼠模型中的差異表達，但lncRNA具體的作用機制尚不清楚。

3.2 lncRNA MRAK088388和MRAK081523 競爭性內源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)的概念于2011年被提出[16]，該假說揭示了一種RNA間相互作用的新機制。已知miRNA可以通過結合m RNA導致基因沉默，而ceRNA可以通過應答元件競爭性結合miRNA，從而阻止miRNA與靶基因的結合，逆轉miRNA導致的基因沉默。2014年，Song 等[17]發現 MRAK088388 和MRAK081523能夠分別通過競爭性結合miR-29b-3p和let-7i-5p調控N4bp2和Plxna4的表達。此外，通過原位雜交發現MRAK088388和MRAK081523位于肺間質細胞的細胞質中。該研究初步提出了lncRNA作為ceRNA競爭性結合miRNA調節基因的表達，從而導致肺纖維化的發生。

3.3 lncRNA uc.77和2700086A05Rik EMT是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的過程，主要表現為上皮細胞標志的失去和間質細胞標志的獲得，同時細胞形態變為紡錘形，失去與基底膜的連接，從而獲得遷移能力。已有的體內和體外研究證明，EMT是IPF肺組織中肌成纖維細胞的重要來源，并且在IPF肺組織標本中證實氣道上皮細胞和肺泡上皮細胞均能夠發生EMT[18]，EMT在肺纖維化的形成和發展過程中發揮了重要作用。2015年，Sun等[19]發現lncRNA uc.77和2700086A05Rik分別通過調節靶基因ZEB2和HOXA3來參與EMT，從而參與肺纖維化的發展。該研究結果揭示了lncRNA在肺纖維化過程中調控EMT的重要作用。

3.4 lncRNA n341773和CD99P1 Huang等[20]發現34種lncRNA與miRNA有潛在的結合位點，其中有23種在人肺組織中表達。在23種lncRNA中，發現9種lncRNA在IPF中表達失調：n370929、CD99P1、NR_003085、n338680、n341773和n364035表達下調，n342143、n373263和NR_045756表達上調。進一步研究發現，lncRNA n341773增加肺成纖維細胞的膠原表達，CD99P1抑制肺成纖維細胞增殖和肌成纖維細胞分化。這一發現可能為IPF的治療提供新的方向。

3.5 lncRNA CHRF 據報道，lncRNA CHRF通過ceRNA機制競爭性結合miR-489，從而解除miR-489對心肌肥厚中靶基因的抑制[21]。2016年，Wu等[22]通過miRNA芯片篩檢發現miR-489在二氧化硅誘導的肺纖維化肺組織中明顯降低，通過對miR-489的深入研究，發現在整體動物水平上調miR-489可減輕矽塵誘導的肺纖維化；在細胞水平通過構建矽塵誘導的巨噬細胞模型和轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)誘導的成纖維細胞模型，發現miR-489主要通過調控炎癥通路重要分子MyD88和TGF-β通路重要分子Smad3來減輕矽塵誘導的肺纖維化，lncRNA CHRF可吸附miR-489，解除其對靶基因MyD88和Smad3的抑制作用，進而激活炎癥和纖維化信號通路，表明lncRNA CHRF/miR-489/MyD88 Smad3信號軸在二氧化硅誘導的肺纖維化中發揮關鍵作用。

3.6 lncRNA H19 據報道，lncRNA H19與多種疾病密切相關。Xie等[23]發現lncRNA H19上調促進腎纖維化。Zhu等[24]發現lncRNA H19/miR-675軸通過靶向TGFBI抑制前列腺癌轉移。miR-141和lncRNA H19之間相互作用，在胃癌中調節細胞增殖和轉移[25]。2016年，Tang等[26]證實lncRNA H19通過與miR-29b相互作用調控肺纖維化，兩者呈負相關，并且lncRNA H19與肺纖維化基因COL1A1和Acta2的表達呈正相關。2018年，Lu等[27]進一步研究發現，在博來霉素誘導的小鼠模型和TGF-β誘導的活化成纖維細胞中lncRNA H19的表達上調，并且敲除lncRNA H19減輕了肺纖維化，這與Tang等[26]的研究結果一致。此外，Lu等[27]還發現lncRNA H19作為ceRNA通過與miR-196a結合調節COL1A1的表達，從而調節肺纖維化進展。

3.7 lnc-PCF TGF-β1能夠誘導許多細胞的形態學和細胞表型轉化，包括EMT，是肺纖維化的形成中關鍵的致纖維化細胞因子之一。2017年，Liu等[28]發現lnc-PCF可以通過調節TGF-β1激活的上皮細胞的增殖來促進纖維化，進一步的實驗證實，lnc-PCF促進活化上皮細胞的增殖依賴于miR-344a-5p，miR-344a-5p通過其靶基因map3k11發揮調控功能。這些結果表明，lnc-PCF可以通過直接靶向miR-344a-5p來調控map3k11，從而加速肺纖維化，這可能是IPF潛在的治療靶點。

3.8 lncRNA PCAT29 lncRNA PCAT29與前列腺癌相關。Malik等[29]發現敲除lncRNA PCAT29能夠促進前列腺癌細胞的增殖和遷移。Liu等[30]證實過表達lncRNA PCAT29可改善肺纖維化，并且lncRNA PCAT29通過TGF-β1介導的RASAL1/ERK1/2信號通路抑制肺成纖維細胞分化，TGF-β1介導的信號通路受miR-221的調節。

3.9 lncRNA-ATB 2018年，Liu等[31]通過構建矽塵誘導的小鼠肺纖維化模型，發現miR-200c的表達水平明顯降低，而在小鼠體內高表達miR-200c后對矽塵誘導的肺纖維化有一定阻滯作用。通過細胞實驗，進一步發現巨噬細胞可以通過分泌TGF-β1促進肺上皮細胞lncRNA-ATB表達升高，通過結合吸附的方式降低游離miR-200c水平，釋放miR-200c的靶基因ZEB1，促進肺纖維化過程中肺泡上皮細胞EMT的發生、發展，從而闡明了lncRNA-ATB參與肺泡上皮細胞EMT的分子機制。

3.10 lncRNA PFAL 隨著對lncRNA研究的深入，2018年Li等[32]發現lncRNA PFAL在博來霉素誘導的肺纖維化模型中及TGF-β1誘導的纖維化肺成纖維細胞中表達升高，進一步研究表明lncRNA PFAL可通過調節miR-18a導致肺成纖維細胞中的細胞外基質沉積和纖維化發生。另外，在動物水平和細胞水平敲除lncRNA PFAL均可減輕肺纖維化。

3.11 lncRNA CDKN2B-AS1 先前已有研究證實IPF患者的肺癌發病率高于健康人，IPF被認為是肺癌的獨立危險因素[33]。Du等[34]發現lncRNA CDKN2B-AS1可能通過調控它的鄰近基因m RNA CDKN2A影響p53信號通路，導致肺纖維化合并肺癌的風險增高；另外，通過體外實驗，進一步證實了lncRNA CDKN2B-AS1通過調控CDKN2A發揮作用。

3.12 lncRNA PFRL IPF患者病死率高，預后差，診斷后中位生存期為2～4年。2018年，Jiang等[35]發現miR-26a可以減輕博來霉素誘導的小鼠肺纖維化，而lncRNA PFRL是生物信息學分析預測的唯一與miR-26a有潛在結合位點的lncRNA。因此，Jiang等利用博來霉素和TGF-β1分別在體內和體外水平構建肺纖維化模型，發現肺纖維化模型中lncRNA PFRL表達升高，進一步研究表明lncRNA PFRL可通過miR-26a誘發肺成纖維細胞膠原合成，促進肺成纖維細胞增殖、遷移和分化。同時，敲除lncRNA PFRL可以減輕TGF-β1誘導的肺成纖維細胞的纖維化以及博來霉素誘導的小鼠肺纖維化。lncRNA PFRL在IPF中表達升高以及其對miR-26a的調控作用可能作為肺纖維化疾病防治的新靶點。

3.13 lncRNA PFAR 2018年9月，Zhao等[36]首次發現lncRNA PFAR作為miR-138的ceRNA，通過調節YAP1-Twist軸促進肺成纖維細胞活化和細胞外基質沉積，更重要的是，沉默lncRNA PFAR抑制了博來霉素誘導的小鼠肺纖維化。這些結果表明lncRNA PFAR可能是預防和治療肺纖維化的新策略。

IPF的發病機制不明，預后不良，病死率高，缺乏有效的治療措施，目前已受到越來越多的關注。近年來，隨著功能基因組學的飛速發展，人們已經逐漸認識到lncRNA在IPF的發病機制中有著重要的作用，并可能成為潛在的生物標志物和治療靶點。研究發現，肺纖維化組織和正常的肺組織中存在數百種差異表達的lncRNA，lncRNA作為ceRNA競爭性結合miRNA，調控靶基因的表達，從而參與EMT，促進肺纖維化的發生、發展，受到了廣泛的關注，但具體的分子機制仍有待進一步研究。由此可見，失調的lncRNA可能是包括肺纖維化在內多種疾病的重要生物學標志，進一步深入研究lncRNA在IPF中的作用機制并對其特定靶點實施干預，可能為IPF的治療提供新的思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突