小黑麥對石油污染鹽堿土壤細菌群落與石油烴降解的影響

王 拓,唐 璐,欒 玥,張 淼,陳佳欣,郭長虹

哈爾濱師范大學生命科學與技術學院, 黑龍江省分子細胞遺傳與遺傳育種重點實驗室, 哈爾濱 150025

石油是當下社會經濟發展不可或缺的主要能源之一,廣泛運用在各行各業,為人類生活帶來便利[1]。然而,在石油開采、儲運和使用過程中,油溢滲漏等事故導致石油污染日益嚴重[2]。大量的石油烴類化合物進入土壤,會影響和改變土壤結構的組成,生物化學循環以及土壤微生物群落多樣性,對土壤肥力的可持續性和環境造成嚴重的負面影響[3]。另外,許多石油開采區的地理位置往往位于海域鹽堿灘或內陸鹽堿土區域,從而導致鹽堿土受到原油溢油污染的現象廣泛出現,例如墨西哥灣曾發生石油泄漏和溢油事故污染了當地鹽堿土[4]。目前,這種鹽堿土石油污染所造成的土壤環境惡化已經成為一類突出的環境問題。

植物修復是用特定的植物來清除或降低土壤中污染物質的一種技術,這種技術依賴于植物的生長,植物的生長狀態直接影響修復效果。有研究表明,鹽堿脅迫和石油污染會改變土壤環境,導致大部分植物難以在石油污染的鹽堿土壤中生長,無法在環境修復中有效的發揮作用[5]。小黑麥(TriticalehexaploideL.),是普通小麥和黑麥屬間雜交和染色體加倍而人工合成的物種,具有光合作用能力旺盛、抗逆性強等優點[6- 8]。我們在之前的研究中,篩選到了在石油污染的鹽堿土壤中可以較好地存活并生長的小黑麥品種[9],并將其作為本研究的修復植物。同時,石油污染鹽堿土的植物修復研究無法忽略土壤中的微生物群落,尤其是植物的根際微生物被認為在植物修復進程中起到關鍵作用。土壤微生物群落可以敏感地察覺出土壤環境的改變,其中細菌作為土壤微生物中重要的組成成分,它的群落結構組成可以反映出土壤的理化性質,以及對不良環境的耐受性[10]。修復植物可以提高土壤對污染物的降解作用,且修復過程會使土壤微生物的結構呈現出明顯的變化[11]。研究石油污染土壤細菌的群落結構和多樣性對植物修復的響應會為了解污染土壤的修復機制提供一定的幫助。

本研究采用高通量測序技術,分析小黑麥種植對不同濃度石油污染的鹽堿土壤中根際細菌群落結構及多樣性的影響,同時測定了土壤石油烴的降解率,以揭示石油污染鹽堿土壤的植物修復過程中根際細菌群落結構的變化規律,為石油污染鹽堿土壤的植物修復技術提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗植物及土壤的制備

小黑麥 (TriticalehexaploideL.) 哈師2號種子,由哈爾濱師范大學分子細胞遺傳與遺傳育種實驗室提供。盆栽實驗所需土壤取自黑龍江省大慶市鹽堿樣地,土壤取回后經風干,過篩,得到無石塊和雜物的鹽堿土,留以使用。石油污染鹽堿土壤的制備：根據實驗設計中1 g/kg、5 g/kg的石油濃度,稱取相應質量的石油(采自大慶油田)和鹽堿土壤(土壤基礎理化性質：pH值9.0、磷21.1 mg/kg、鉀176 mg/kg、有機物18.22 g/kg),用一定量的石油醚完全溶解石油,將石油—石油醚溶液按相應濃度倒入對應的鹽堿土壤中,攪拌混勻后放在通風處,待石油醚揮發徹底即可制成實驗所需土壤。

1.2 盆栽實驗方案

設定0 g/kg、1 g/kg和5 g/kg三個石油濃度的處理組,將種植小黑麥的不同石油濃度實驗組記為X0、X1、X5,并以對應的石油濃度的未種植小黑麥的土壤作為對照組,分別記為CK0、CK1、CK5,每個處理設置4個重復。將制備好的土壤分裝入各花盆中,定量稱取0.5 kg土/盆,每盆播種10粒小黑麥種子。待小黑麥種植1.5個月后測定小黑麥的株高,并取其根際土,土樣去除大土塊、植物殘體等雜質,裝入密封袋,一部分放于-80℃用以高通量測序,另一部分自然風干,用于石油烴含量測定。

1.3 土壤石油烴含量的測定

土壤中石油烴含量的測定采用索式萃取重量法進行[12- 13]。在每種石油濃度處理組中各取一定質量(m1)的風干土樣(研磨過篩1 mm)與1 g無水硫酸鈉混合,攪拌均勻后,用濾紙包裹并放入索氏提取器中,滴加0.6 mL 1 mol/L HCl到濾紙包上,于50℃下用二氯甲烷回流5 h。取下接收瓶,冷卻后,將接收瓶中的二氯甲烷提取液倒入分液漏斗中。搖晃振動分液漏斗1—2 min,靜置分層,將其下層的二氯甲烷提取液用10 g無水硫酸鈉過濾脫水,將濾液濾入蒸發皿(稱取重量m2)。將蒸發皿置于50℃的烘箱中烘干,待其恒重時稱取重量(m3)。根據土壤樣品的質量變化計算出石油烴降解率。石油烴降解率計算公式為：[m0-(m2-m3)×1000/m1]/m0×100%,m0為土壤中添加的石油濃度。

1.4 土壤DNA提取、PCR擴增和高通量測序

土壤樣品的DNA提取采用PowerSoil DNA提取試劑盒(Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.),稱取0.3—0.5 g新鮮土壤樣品,按試劑盒規定的實驗步驟提取土壤總DNA。利用細菌引物對515F- 907R區進行PCR擴增,引物序列分別為515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG- 3′),907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT- 3′)。接頭后的引物含有不同的Barcode以區分不同樣品。PCR反應體系為20 μL：5×PCR buffer 4 μL,dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL,正向引物0.4 μL(5 μmol/L),反向引物0.4 μL(5 μmol/L),0.4 μL Premix Taq DNA聚合酶,DNA模板量10 ng。PCR擴增條件：94℃ 3 min；94℃ 20 s,55℃ 20 s,72℃ 30 s,20個循環；72℃ 5 min。PCR結束后,引入Illumina橋式PCR兼容引物進行第二輪擴增。對PCR產物進行瓊脂糖電泳,并采用瓊脂糖試劑盒回收,QuantiFluorTM-ST (Promega, USA)檢測試劑盒對回收的DNA精確定量,每一樣品DNA量取10 ng,按1∶1等量混合后采用Illumina公司的Miseq平臺測序。

1.5 數據分析及處理

根據Barcode序列拆分各樣品數據,截取Barcode和引物的序列使用FLASH對其進行拼接。高通量測序數據使用QIIME進行數據處理：利用UPARSE軟件對全部有效序列進行聚類,默認以97%序列相似性對序列聚類獲得操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)。采用RDP classifier 2.12對97%相似度水平的OTU 代表序列進行分類學分析,得到每個OTU 對應的物種分類信息,并在界、門、綱、目、科、屬水平上統計各個樣品的細菌群落組成。基于物種分類分析,繪制物種分類條形圖和物種豐度熱圖。利用QIIME 1.8 軟件進行樣品Alpha 多樣性分析,計算ACE、Chao1、Shannon、Simpson 等物種多樣性指數[14- 16]。基于Alpha多樣性指數進行稀釋性分析。在分析細菌群落結構時,將樣品中無法鑒定到這個分類水平的類群統稱為未知類群(Unclassified),將相對豐度較低的類群合并,統稱為其他類群(Others),然后繪制不同分類水平上細菌類群的相對豐度圖。

實驗數據采用Microsoft Excel 2010處理,顯著性分析采用IBM SPSS Statistics 20統計軟件單因素方差分析(ANOVA)得到各處理間數據差異[14],利用鄧肯(Duncan)檢驗進行多重比較,顯著差異水平P< 0.05。

2 結果與分析

2.1 小黑麥對土壤石油烴降解作用的影響

對土壤的石油烴含量進行測定,并對土壤石油烴降解率進行了分析(圖1)。結果表明,X1組的石油烴降解率是56%,而CK1組的土壤石油烴降解率為19.33%,表明在土壤石油濃度為1 g/kg時,種植小黑麥提高了土壤36.67%的石油烴降解率。X5組的石油烴降解率是44.27%,而CK5組的土壤石油烴降解率為11.07%,表明在土壤石油濃度為5 g/kg時,種植小黑麥提高了土壤33.20%的石油烴降解率。因此,種植小黑麥組的石油烴降解率均顯著高于無植物種植的對照組(P< 0.05)。

2.2 土壤細菌多樣性和群落結構分析

2.2.1土壤測序數據分析

為了解種植小黑麥對石油污染鹽堿土壤的細菌群落結構的影響,利用Illumina Miseq高通量測序技術,對不同處理樣品的細菌16S rRNA進行測序。經優化后6個處理組分別得到21398—27899條序列。基于樣品稀釋性曲線(圖2), 6個土壤樣品的OTUs數隨著序列讀取數量的增加先快速上升而后轉變為緩慢地上升,說明隨著序列讀取數量的增加OTUs數已經開始趨于平緩,此外,測序的覆蓋度(Coverage值)均大于96%(表1),證明該測序量已可以代表樣本中微生物的真實情況。

圖1 石油烴降解率Fig.1 degradation rate of Total Petroleum Hydrocarbons(TPH)不同字母表示統計學上的差異(P<0.05)

圖2 樣品稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curve analysis of OTUs

2.2.2土壤細菌多樣性分析

通過計算土壤樣品的Ace指數(Ace index)、Chao1指數(Chao1 index)、辛普森指數(Simpson index)和香農指數(Shannon index),對土壤細菌多樣性進行了分析(表1)。Ace指數和Chao1指數可代表土壤細菌群落的豐度,辛普森指數和香農指數可代表土壤細菌群落的多樣性。結果表明,X1組的細菌群落香農多樣性指數是6.25,而CK1組是5.95；X5組的細菌群落香農多樣性指數是5.97,而CK5組的土壤細菌群落香農多樣性指數為5.84,表明在土壤石油濃度為1 g/kg和5 g/kg時,種植小黑麥均會提高土壤細菌多樣性。另外,從Chao1指數也可以看出,種植小黑麥提高了土壤細菌的豐度。在種植小黑麥以后土壤細菌群落的土壤的香農指數、Ace 指數、Chao1 指數值顯著增加,辛普森指數降低.說明向土壤中種植小黑麥進行修復處理可提高污染土壤的微生物豐富度和均勻度。以上結果表明,種植小黑麥提高了石油污染鹽堿土壤細菌的豐度和多樣性。

表1 不同處理組土壤細菌豐富度和多樣性

2.2.3土壤細菌群落結構組成分析

在細菌群落“門”的分類水平上對土壤的細菌群落結構組成進行了分析(圖3)。結果表明,在6個土壤樣品中,放線菌門(Actinobacteria 8.33%—26.61%)、變形菌門(Proteobacteria 20.00%—51.16%)、酸桿菌門(Acidobacteria 13.96%—17.04%)、擬桿菌門(Bacteroidetes 6.51%—26.12%)、綠彎菌門(Chloroflexi 3.40%—7.37%)占有主要優勢地位。

圖3 門水平土壤細菌群落結構Fig.3 Soil bacterial community at the phylum levels

在無石油污染的鹽堿的土壤中,與未種植小黑麥的對照組相比(CK0),種植小黑麥處理組(X0)的變形菌門、芽單胞菌門、浮霉菌門和酸桿菌門的相對豐度較高,而放線菌門的相對豐度明顯下降。在1 g/kg 和5 g/kg濃度的石油污染土壤中,X1和X5土樣中的變形菌門的相對豐度為31.94%和51.16%,而在CK1和CK5土樣中其相對豐度為20.15%和20.00%。酸桿菌門X1和X5土樣中的相對豐度為16.35%和15.71%,在CK1和CK5土樣中其相對豐度為13.96%和14.64%。而放線菌門,擬桿菌門和厚壁菌門(Firmicutes)較對照的相對豐度有所降低。在6個土壤樣品中,不同土壤樣品中的未分類種群的數值有一定的波動變化,種植小黑麥后相對豐度顯著增加。

在細菌群落“綱”的分類水平上發現(圖 4),6個土壤樣品中放線菌綱(Actinobacteria)、酸桿菌綱(Acidobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、黃桿菌綱(Flavobacteriia)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria)占有主要優勢地位。種植小黑麥以后,γ-變形菌綱、β-變形菌綱、芽單胞菌綱、δ-變形菌綱的相對豐度都有上升,而放線菌綱、黃桿菌綱、微酸菌綱、芽孢桿菌綱、熱微菌綱這幾種菌綱的相對豐度都有降低。在X0組中,酸桿菌綱、β-變形菌綱、α-變形菌綱、γ-變形菌綱為主要分類群。在1 g/kg和5 g/kg石油濃度下,酸桿菌綱在X1組中的豐度最高,為16.35%；而γ-變形菌綱在X5土壤樣品中的豐度值最高,為28.33%。除此之外,在石油污染的鹽堿土壤中,黑麥草的種植提高了芽單胞菌綱、δ-變形菌綱、鞘脂桿菌綱 、浮霉菌綱、硝化螺旋菌綱以及未分類的其他菌群的相對豐度。

圖4 綱水平土壤細菌群落結構Fig.4 Soil bacterial community at the class levels

進一步利用熱圖在細菌“屬”的水平上進行了分析(圖5)。共統計了36個主要優勢菌屬,與CK0相比,X0組的土壤樣品中亞硝化單胞菌-不可培養菌屬(Nitrosomonadaceae_uncultured,5.83%)、噬纖維菌科-不可培養菌屬(Cytophagaceae_uncultured,3.37%)和芽單胞菌科-不可培養菌屬(Gemmatimonadaceae_uncultured,2.19%)這三個菌屬的相對豐度提高。在1 g/kg和5 g/kg石油濃度下,與CK1相比較,X1組中的亞硝化單胞菌-不可培養菌屬(4.63%)、噬纖維菌科-不可培養菌屬(4.42%)、烷烴降解菌科-未命名菌屬(Alcanivoracaceae_norank,2.63%)的相對豐度明顯增加；與CK5相比較,X5組土壤樣品中的烷烴降解菌科-未分類菌屬、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、亞硝化單胞菌-不可培養菌屬、叢毛單胞菌科-未分類菌屬(Comamonadaceae_unclassified)這幾個菌群的相對豐度增加。種植小黑麥后在石油污染的土壤中有一部分菌屬的數量相比未種植土壤更多,比如硝化單胞菌-不可培養菌屬、噬纖維菌科-不可培養菌屬、芽單胞菌科-不可培養菌屬、烷烴降解菌科-未命名菌屬、黃單胞菌屬、叢毛單胞菌科-未分類菌屬、浮霉狀菌屬(Planctomyces)、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、豐佑菌屬(Opitutus)、水小桿菌屬(Aquabacterium)、鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas),其中烷烴降解菌科-未命名菌屬、Subgroup_6_norank、黃單胞菌屬、亞硝化單胞菌-不可培養菌屬、34P16_norank這幾個菌群的相對豐度比較高。

圖5 各土壤樣品在屬水平上的細菌群落結構熱圖Fig.5 The heatmap of bacterial community structures of soil sampiems at level of genus熱圖的縱坐標表示的為不同的細菌菌屬,橫坐標表示的為每一個土壤樣品,圖中不同顏色色代表著菌屬的豐度變化,越偏向紅色豐度越高,而越偏向藍色豐度越低

3 討論

植物修復具有成本低、可進行大面積原位操作、無二次污染等特點,因而備受人們的青睞[17- 18]。但是針對于石油污染的鹽堿土壤環境,許多植物都無法正常生長,也就無法發揮出修復作用。鹽堿土壤的高鹽含量以及高pH值會影響植物的生長狀況,所以本研究選取耐鹽堿的小黑麥作為石油鹽堿雙重污染地區的修復植物。許多研究表明,種植植物能夠增加土壤根際微生物的多樣性與豐度,以提高土壤對污染物的消除修復能力[11]。在石油烴污染的土壤中種植麒麟草、大葉鉆天楊、深裂歐地草,顯著改變了根際土壤細菌群落結構[19]。種植狗牙根(Cynodondactylon)、馬藺(Irislactea)等植物均可以提高土壤微生物的多樣性,改善根際土壤的微環境,降低土壤中的石油烴含量,從而有效地修復PHCs污染土壤[20- 21]。本研究發現,種植小黑麥不僅顯著提高了鹽堿土壤的石油烴降解率,還增加了根際土壤細菌多樣性和豐度,這與利用黃花苜蓿(MedicagofalcataL.)和紫花苜蓿(MedicagosativaL.)[22]等植物進行鹽堿土石油污染修復的研究結果相一致。根據調查研究發現,種植植物后對石油污染土壤的修復作用體現在以下幾點,一是修復植物自身可以吸附利用有機污染物,二是由于根系分泌物為微生物提供了營養,故增加了根際微生物的豐度,從而促進土壤中石油烴類化合物的降解[23],三是植物根系可以通過向土壤中釋放分泌物和氧氣,同時打破土壤的物理化學結構,從而有效增加污染土壤中的微生物群落,促進石油烴的降解[24]。這表明了植物修復的過程不僅是植物本身在起作用還包含著土著微生物的參與以及植物與土著微生物之間的相互作用帶來的影響。

土壤微生物是重要的土壤活性組成成分,在土壤的有機物質的分解和轉化過程中發揮重要的作用[25]。植物生長可以影響其凋落物的產生和分解、根系的周轉以及根系分泌物的產生等活動,這些活動能夠影響土壤碳和氮含量等微生物生長和繁殖提供所必需的碳源和能量,從而影響微生物群落結構[26]。同時,土壤中的石油也會影響土壤的細菌群落組成。Sutton等人對長期柴油污染土壤26個樣品微生物群落組成和多樣性的研究結果表明,變形桿菌、放線菌門、酸桿菌門和綠彎菌門是主要的微生物類群[27]。在Liao等人的研究中發現,華北油田中的優勢菌為放線菌及擬桿菌[28]。而在本研究中,發現石油污染的鹽堿土壤的優勢細菌菌群是放線菌門、變形菌門、酸桿菌門、擬桿菌門和綠彎菌門,這與他人的研究結果基本相符。在種植小黑麥的土壤中,還會發現變形菌門相對豐度明顯增加,而放線菌門,擬桿菌門和厚壁菌門較對照的相對豐度有所降低。變形菌門由一群革蘭氏陰性細菌組成,可以降解石油碳氫化合物[29]。在“綱”的分類水平上,種植小黑麥后γ-變形菌綱、芽單胞菌綱、β-變形菌綱和δ-變形菌綱的相對豐度有小幅度增加。屬于變形菌門的γ-變形菌綱的相對豐度增加幅度較明顯。Gao等人通過研究不同程度鹽堿化和原油污染的土壤中微生物群落的變化,發現γ-變形菌綱在修復石油污染土壤的過程中起著重要作用[5]。同樣,在放線菌門和酸桿菌門中也包含有特異的碳氫化合物降解細菌,它們對于土壤中的碳、氮和其他的營養物質的循環有著重要的作用。Allen的研究表明,在長期石油污染的地區可以發現酸桿菌門,認為這部分細菌參與了污染土壤的修復過程[30]。

本研究通過細菌菌屬的相對豐度分析發現,在石油污染的鹽堿土壤種植的小黑麥根際,亞硝化單胞菌屬、噬纖維菌科-不可培養菌屬、芽單胞菌屬、烷烴降解菌科-未命名菌屬、黃單胞菌屬和叢毛單胞菌科-未分類菌屬等優勢度較高,而在無石油污染及未種植植物對照組中這些菌群的優勢度較低,清楚地表明石油污染土壤中含有獨特的石油降解細菌群落,同時小黑麥的種植會增加石油降解細菌群落的相對豐度。這些優勢菌屬中,亞硝化單胞菌是一種氨氧化細菌,能把氨氧化為亞硝酸,在土壤氮循環中發揮著重要作用,有助于給植物提供氮素[31]。而烷烴降解菌科-未命名菌屬和黃單胞菌屬則與石油污染物的降解有關,研究發現烷烴降解菌科-未命名菌屬是一種能夠降解烷烴的嗜鹽菌,可以利用石油烴組分作為碳源在中度至高鹽環境中生長,同時在研究中發現黃單胞菌是一種污染程度較低時的高效石油降解菌[32- 34]。在本研究中檢測出來的叢毛單胞菌科是一類有機物質的天然分解者,這與Sun等人的研究對次生污染(運移油)樣品中叢毛單胞菌科含量顯著的結果相似[35]。本研究結果表明,在石油污染的中會出現一類獨特的以石油及石油分解物為碳源的微生物群,例如烷烴降解菌、黃單胞菌以及叢毛單胞菌等等,同時種植小黑麥會促進石油污染的鹽堿土壤中這類微生物的生長,加速對土壤中石油烴類污染物的降解。

綜上所述,種植小黑麥不僅自身可以耐受石油鹽堿的雙重脅迫,還可以增加根際土壤細菌群落的多樣性,并通過構建良好的微生物群落結構來加強修復效果,從而在鹽堿土壤中達到一個較高的石油烴的降解率。