1型糖尿病動物模型和干細胞治療的研究進展

陳昕濤，王敏君，嚴文韜，孫 宇，楊 桃，朱海英，胡以平，*，陳 費，*

(1.海軍軍醫大學基礎醫學院細胞生物學教研室，上海 200433；2.海軍軍醫大學基礎醫學院學員四大隊，上海 200433)

糖尿病是一種以高血糖為特征，由致病因素引起胰島素分泌缺乏或胰島素抵抗繼而引發糖代謝紊亂的疾病。目前分為1型糖尿病、2型糖尿病、特殊類型糖尿病和妊娠期糖尿病。1型糖尿病是一種由T淋巴細胞介導的自身免疫性疾病，由于胰腺β細胞被破壞導致胰島素分泌相對不足，進而使機體多器官長期暴露于高血糖環境，導致嚴重的心血管、眼、腎及神經系統病變。如治療不當或不及時將會出現嚴重的并發癥，輕者影響患者的生活質量，重者導致患者死亡[1]。根據國際糖尿病聯盟的統計，截至2015年，全球已有4.15億糖尿病患者，另有3.18億成年人處于糖耐量異常狀態，而糖耐量異常的人群發生糖尿病的風險很高。目前1型糖尿病主要治療方法是藥物治療，患者需要保證不間斷高質量的胰島素注射。1型糖尿病患者目前仍無法治愈，終生藥物治療增加了感染、酮癥酸中毒、低血糖等急性并發癥及視網膜、神經、腎臟、心腦血管疾病等慢性并發癥的風險。胰腺β細胞的再生治療和替代治療或成為治愈1型糖尿病的有效途徑，但這種治療方式面臨的難題是胰腺β細胞來源不足及在體內血糖調節功能不能長久維持。相關研究表明，通過對干細胞誘導分化、重編程以及轉分化技術獲得的有功能的胰島素分泌細胞具有廣闊的前景，而糖尿病的動物模型作為研究細胞替代法治療1型糖尿病的驗證工具起到了至關重要的作用。本文根據目前的研究現狀綜述了1型糖尿病常見動物模型以及相關干細胞治療這些模型的研究進展，以期引發思考，開闊思路，為干細胞治療1型糖尿病的臨床轉化提供參考和借鑒。

1 1型糖尿病常見動物模型

1型糖尿病的主要特征是胰腺β細胞受到自身免疫系統的攻擊，導致胰島素分泌不足。因此，在制備動物模型時，可以通過不同的方法使動物胰島素缺失。根據造模的不同方法，1型糖尿病動物模型主要包括3大類型：化學損傷胰腺β細胞1型糖尿病動物模型、自發性1型糖尿病動物模型、病毒感染誘導1型糖尿病動物模型。

1.1 化學損傷法制備1型糖尿病動物模型

該方法主要通過化學手段對胰腺β細胞進行大量破壞，導致內源性的胰島素急劇減少，引發模型動物糖耐量異常、高鎂血癥和體質量減輕等癥狀[2]。由化學損傷法制備1型糖尿病動物模型操作十分簡便，既可以用于對嚙齒類動物造模，也適用于更高等的動物。如向豬注射化學試劑可以誘導1型糖尿病的發生[3]。一般通過兩種試劑來引發1型糖尿病：鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)和四氧嘧啶(alloxan，ALX)。

STZ是一種使胰腺β細胞產生毒素的廣譜抗菌素，它通過葡萄糖轉運蛋白2(GLUT2)轉運到胰腺β細胞，導致其DNA發生烷基化，生成NO和自由基，破壞細胞，致使β細胞無法分泌胰島素，因而出現1型糖尿病癥狀[4]。STZ注射一般有兩種方式，一是單次大劑量注射，注射藥物劑量為150～200mg/kg。單次大劑量注射操作方便省力，用藥節約，但模型的成模率不是很高；另一種方式為多次低劑量注射STZ，劑量通常為50mg/kg，連續5d，低劑量注射逐步損傷胰島細胞，可以引發自身對胰島的免疫應答，最終使模型動物血糖調節失代償，出現多飲、多尿、血糖持續偏高的1型糖尿病癥狀。相比于單次大劑量注射，多次低劑量注射的成模率高，且死亡率低[5]。單次大劑量注射STZ的誘導模型目前廣泛用于1型糖尿病藥物試驗，而多次小劑量誘導模型主要用于探討胰島壞死以及增殖的機制。

四氧嘧啶(ALX)是一種尿酸類衍生物，進入機體代謝后產生5-羥基巴比土酸、過氧化物和超氧自由基。超氧自由基與葡萄糖轉運體GULT2結合，進入胰島β細胞后使DNA烷基化，因而可以選擇性的破壞胰腺β細胞，引起胰島素缺乏，致使模型動物出現1型糖尿病典型癥狀。ALX的注射劑量通常為100～200mg/kg，缺點是對機體的其他器官毒性很大，因此不能通過加大劑量的腹腔注射來取代尾靜脈注射，但劑量不足又會導致成模率不高。有研究[6]表明劑量為37.5mg/kg分3次隔天注射的方案較為合適，這樣對胰腺β細胞的損傷作用較為緩和，血糖逐步上升，可以明顯降低模型動物死亡率并提高成模率。

上述的兩種化學法通過化學毒素類物質破環胰島細胞，可以在較短時間內引起胰島素分泌大量減少，一定程度上模擬出了1型糖尿病患者多飲、多尿、血糖增高、體質量減輕的癥狀。因STZ和ALX的穩定性不強，所以在注射時應注意試劑現配現用，遮光保存等。

1.2 自發性1型糖尿病動物模型

1.2.1 NOD小鼠 NOD小鼠(non-obesediabeticmouse)是JCL-ICR品系的糖尿病小鼠近親雜交而得到的非肥胖型小鼠，其生理特征是多飲、多尿、高血糖，與人類的1型糖尿病癥狀十分接近，屬于自發胰島素依賴型糖尿病小鼠。NOD小鼠從發病到死亡的時間約為22d，在發病之前，會伴有胰腺炎、胰島素分泌逐漸減少的癥狀。NOD小鼠自身免疫性胰島炎最早于4周齡時發生，患鼠的胰島會被淋巴細胞浸潤形成胰腺炎，進而導致胰島的萎縮和纖維化。NOD小鼠與人類1型糖尿病有所不同的是，即使沒有胰島素的注射治療，NOD小鼠也可存活數周，不會因為酮血癥而死亡[7]。目前，NOD小鼠主要用于1型糖尿病藥物的篩選以及1型糖尿病遺傳機制的研究。

1.2.2 BB大鼠 BB大鼠是于1974年由加拿大渥太華Bio-Breeding生物育種實驗室發現的，其發病是由于遺傳型和自身免疫反應所致。BB大鼠的自身免疫系統如T細胞、B細胞和巨噬細胞會毀壞胰腺β細胞，引起胰腺炎而導致胰島素分泌缺乏。與NOD小鼠不同的是，BB大鼠會因胰島素缺乏引發的酮血癥而很快死亡，并且CD8+和CD4+淋巴細胞會減少[8]。BB大鼠的臨床表現與人類1型糖尿病十分相似，所以BB大鼠作為1型糖尿病模型被廣泛使用。

自發性糖尿病動物模型可以很好的模擬出1型糖尿病的臨床癥狀，其遺傳性和人類的1型糖尿病十分相似，因此是作為研究干細胞治療1型糖尿病的理想動物模型。

1.3 病毒感染法誘導1型糖尿病動物模型

病毒可以通過兩種方式誘導1型糖尿病的發生：一是病毒直接感染胰腺β細胞，導致胰腺β細胞大面積被破壞，如Kilham大鼠病毒；二是誘導機體產生對胰腺β細胞的免疫反應，從而產生特異性免疫疾病，如腦心肌炎病毒。此外也有研究培育出了轉基因動物模型，該模型中胰島素啟動子啟動淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(lymphocyticchoriomeningitisvirus，LCMV)抗原的表達。此模型小鼠平時不會出現胰腺β細胞被破壞的癥狀，一旦注射LCMV便會引起小鼠機體內的免疫應答和抗原交叉反應，進而損傷胰腺β細胞，誘發小鼠產生1型糖尿病[9]。

1.4 其他動物模型

目前，對于1型糖尿病動物模型的研究，主要集中于嚙齒類動物，但嚙齒類成模后的病理特征與人類有著較大差異。不僅如此，對于1型糖尿病的治療方法，嚙齒類動物與人的治療效果也存在著較大差異，如對于口服胰島素和煙堿，嚙齒類動物可以取得很好的效果，但卻不適用于人類。因此，對于小型豬與猴等哺乳動物的1型糖尿病動物模型的研究便孕育而生，通常也使用STZ誘導其產生1型糖尿病。其中，尤卡坦小豬和哥廷根小豬相對其他品種有著實驗周期短、血液生化指標與人類相似的優勢[10-11]。在所有的動物模型中，與人類的血糖指標、病理特征最為相似的是猴類模型，有報道使用恒河猴成模效果較好[12]。生理上，小型豬與猴的胃腸結構、營養吸收、胰腺發育和形態以及脂質代謝機制與人類相似，尤其值得注意的是豬胰島素與人類只差一個氨基酸，因此，豬胰島的異種移植也成為治療1型糖尿病的方法[13]。但因倫理、實驗成本等問題，大型動物試驗受到了一定的限制。

2 干細胞對1型糖尿病動物的治療作用

目前治療1型糖尿病的主要方法為注射胰島素使患者消除高血糖的癥狀，但缺點在于藥物治療具有胰島素終生依賴性，部分患者存在胰島素抵抗，胰島素將糖化的血紅蛋白下降的同時也易造成低血糖，并且外源性胰島素的注射不能有效避免因糖尿病引起的如視網膜病變、心血管病變、腎臟病變等并發癥的發生。隨著醫學的發展，胰島細胞移植成為治療1型糖尿病的候選方案，但是該方法存在著供體不足和患者本身的排異反應等問題，因而限制了其廣泛應用。近年來，干細胞誘導分化技術的發展和多能干細胞的獲得，為1型糖尿病的細胞治療帶來了新的突破口。干細胞具有多向分化的潛能和自我更新能力，理論上可以誘導干細胞分化為胰腺β細胞進而通過移植來修復或者替代原來受損的胰島。此方法的另一潛在優勢在于，可用自體來源的細胞以避免排斥反應。目前可以分化為胰腺β細胞的干細胞有胚胎干細胞、誘導性多能干細胞、成體干細胞等，成體干細胞主要包括肝干細胞、胰腺干細胞和間充質干細胞等。

2.1 胚胎干細胞

胚胎干細胞被證實可誘導分化為包括胰腺β細胞在內的大多數體細胞。有研究將胚胎干細胞在體外通過轉染胰島素基因的方法，在分化階段加入煙酰胺獲得了具有分泌胰島素功能的細胞，將該細胞簇移植到STZ小鼠體內，STZ小鼠高血糖的癥狀得到了一定程度的緩解，但持續時間不長。在此基礎上，有研究[14]采用分步定向法誘導小鼠胚胎干細胞，將得到的胰島樣細胞簇移植到STZ小鼠體內，形成了類胰島組織，小鼠存活期延長。誘導胚胎干細胞向胰腺β細胞分化的過程十分復雜，目前發現通過ActivinA、丁酸鈉、Exendin4等誘導因子可以較為高效地獲得高純度和高成熟度的胰島素分泌細胞。

胚胎干細胞的胰向分化為治療1型糖尿病提供了希望，其優點在于細胞數量充足，但目前的分化方案所得的胰島素分泌細胞效率不高，葡萄糖刺激后胰島素分泌量低，無法實現血糖的生理調節。此外，胚胎干細胞的分化移植仍面臨癥狀反復、免疫排斥、具有成瘤風險等問題。因此，若想投入臨床，還需探求更合理的胚胎干細胞誘導因子和誘導分化方案[15-17]。

2.2 誘導多能干細胞

誘導多能干細胞是在特定條件下(如病毒轉染外源基因，或者化合物處理等方法)由體細胞獲得的具有多項分化潛能的干細胞，具有胚胎干細胞的相關特性和功能。Zhu等[18]將體細胞來源的誘導多能干細胞在體外分化得到的胰島素生成細胞，移植到1型糖尿病小鼠體內后，可以分泌胰島素。有學者[19]將恒河猴的誘導多能干細胞在體外誘導分化為具有分泌胰島素功能的細胞，隨后移植到免疫缺陷的1型糖尿病小鼠體內，可以降低小鼠50%的血糖水平。

相較于胚胎干細胞，源于自體的誘導多能干細胞免疫原性低，移植后有望代替胰腺β細胞行使分泌胰島素的職能。誘導多能干細胞的優勢在于可源于自體、免疫原性低、暫無倫理學問題，但還存在重編程機制不清、效率低、變異風險高、多潛能細胞致瘤性等問題，因此廣泛應用于臨床還為時尚早。

2.3 成體干細胞

成體干細胞是指存在于成年后各組織器官中具有自我更新能力和一定分化潛能的細胞。該類細胞最大的優勢在于1型糖尿病患者可通過從自體中分離出成體干細胞，在體外定向誘導分化為具有分泌胰島素功能的胰腺β細胞，再移植回體內達到長期治療的目的；相較于胚胎干細胞而言，既克服了由于異體細胞移植而引起的免疫排斥，也避免了相應的倫理問題，成為新的研究熱點。

2.3.1 肝干/前體細胞 肝臟與胰腺具有發育同源性，胚胎期均起源于前腸末端[20]。有研究[21]表明肝干細胞可以作為胰腺β細胞替換治療的一種候選細胞。在肝干細胞向胰腺細胞分化過程中，轉錄因子胰十二直腸同源基因-1(pancreaticduodenal homeobox-1，PDX-1)是關鍵的調控基因之一。有研究表明將PDX-1的重組腺病毒轉染至小鼠肝前體/干細胞之后，經體外培養可以誘導其分化為分泌胰島素的β樣細胞，誘導后的細胞具有胰腺β細胞的超微結構特征和相關表型，移植到1型糖尿病小鼠模型中可以改善小鼠的高血糖癥狀。肝干細胞作為候選細胞具有一定應用前景，其優勢在于易于擴增以及與胰腺同樣起源于內胚層，利于誘導分化。但是肝干細胞目前體外分化效率不高，因此，需要探討更高效的誘導分化方案。

2.3.2 胰腺干/前體細胞 目前認為胰腺前體細胞分布在胰腺導管上皮細胞、胰腺實質和腺泡內。Smukler等[22]將胰管和胰島組織中PDX1+/胰島素+/GLUT2-細胞通過譜系追蹤和流式分選相結合的方法，在體外擴增并誘導分化為胰腺β細胞，移植后改善了STZ小鼠高血糖癥狀。也有研究[23]利用PDX1、NGN3(neurogenin3)和巨噬細胞激活因子A(macrophageactivating factorA，MafA)將胰腺中外分泌細胞轉分化成胰島素分泌細胞，移植后也可減輕糖尿病動物模型高血糖的癥狀。胰腺干/前體細胞目前面臨的問題是存在部位不明確、所得量稀少以及缺乏有效的體外擴增方法。

2.3.3 間充質干細胞 間充質干細胞具有多向分化潛能，取材方便且分布廣泛，可以來源于脂肪、臍帶、臍血、骨髓等。Neshati等[24]將人骨髓間充質干細胞移植到1型糖尿病小鼠中，可以長期穩定的改善小鼠高血糖癥狀。但有研究發現移植人骨髓干細胞的小鼠胰腺組織中并未發現源于人骨髓間充質干細胞的胰島樣細胞，因此認為間充質干細胞并不是直接分化為分泌胰島素的細胞，而是遷移到胰島后，骨髓間充質干細胞可以刺激胰腺β細胞的再生，調節全身免疫反應，通過抑制T細胞的增殖，保護胰腺β細胞免受T淋巴細胞的破壞。間充質干細胞可以分泌細胞因子來修復受傷組織，改善胰腺β細胞的生存微環境[25-26]。此外，間充質干細胞還可以用于改善1型糖尿病的并發癥，如糖尿病腎病。Lee等[27]將人骨髓間充質干細胞經左心房注射入STZ小鼠，可在腎小球中檢測到人源性CD31陽性細胞，可以判斷骨髓間充質干細胞歸巢到腎臟分化形成了內皮細胞，起到保護腎小球的作用。間充質干細胞治療1型糖尿病有著很大的前景，其優點在于來源廣泛、自體移植免疫排斥小，但也有一些潛在問題，如誘導分化的效率不高、機制不明、有成瘤性的危險等。

3 展望

合適的1型糖尿病動物模型對于評價干細胞分化得到的胰腺β細胞有著重要的作用。嚙齒類動物雖然造模容易、數據重復性較高且成本相對較低，但是不能完全模擬人1型糖尿病臨床癥狀，因此無法正確評價干細胞的治療效果。小型豬和猴的1型糖尿病模型是目前評價干細胞是否有治療效果的理想模型。綜上來看，不同來源的干細胞向胰腺β細胞分化是可行的，這為細胞替代法治療1型糖尿病拓寬了方向。由于干細胞來源的不同，分化方法的差異，不同干細胞得到的胰腺β細胞狀態和功能不盡相同，所獲得的胰腺β細胞在體內是否能分泌足夠的胰島素以及是否能響應血糖的動態變化來滿足機體長期的需求還有待探索。